转录组讲师带你读文献(10)-肿瘤免疫动态景观
我在我在04-转录组笔记推文任务列表（半年期）里面安排了6个经典综述和10篇转录组应用文献给大家，可惜愿意沉下心了认真苦学的并不多。（https://share.mubu.com/doc/14uneHKvPg）
所以安排转录组讲师给大家做一下领读：
文章信息
标题：Immune evasion before tumour invasion in early lung squamous carcinogenesis
标题：早期肺鳞状肿瘤发生前的免疫逃避
通讯：Jérôme Galon，Sorbonne Paris Cité, Université Paris Descartes, Université Paris Diderot
杂志：nature，Published online 26 June 2019
文章主要结论：在这里，我们表明免疫激活和免疫逃避发生在肿瘤入侵之前，并揭示肺癌浸润前阶段的相关免疫生物标记物。
生物学背景
EMT（借鉴周运来的文章）
EMT，全称epithelial–mesenchymal transition，又称翻译为上皮间质转换，指的是上皮细胞在一些因素的作用下,失去极性及细胞间紧密连接和黏附连接, 获得了浸润性和游走迁移能力, 变成具备间质细胞形态和特性的细胞的改变。这种行为是可逆的。
EMT的概念最早是1982年由Green-berg和Hay提出。然而，长久以来，科学界对于EMT在肿瘤转移过程中的作用一直存在争议，主要是因为无法在体内观察EMT过程 。
胚胎发育与癌症发展中的细胞可塑性变化有着惊人的相似性，而这种可塑性变化受到上皮间质转化epithelial-mesenchymal transition （EMT）过程的调节。胚胎发育时期，上皮状态和间充质状态的细胞能够自由转化。
上皮间质转化（EMT）使得细胞具备转移和浸润特性。 其反向过程，间质上皮转化mesenchymal-epithelialtransition （MET）赋予了细胞极性变化并失去移动能力。
EMT会促发癌细胞从病灶分离，转移到其它部位，而MET导致癌细胞停留，并在停留处引起新的肿瘤。
在很长一段时间内，许多科学家都认为EMT过程对于肿瘤转移是一个必须条件，EMT过程能够剥夺细胞与邻近细胞紧密结合的能力，使细胞能够在全身范围内迁移。科学家们认为是EMT给了癌细胞“双腿”让它们能够脱离原位肿瘤，转移到其他部位形成肿瘤转移灶。
一、 首先介绍下，EMT发生常见的标志分子。
1.表达减少：E- cadherin，Cytokeratin，ZO-1。
2.表达增多：N- cadherin，Vinmentin，Snail1，Snail2，Twi st，MMP-2，MMP-3，MMP-9。
3.活性增加：ILK，Rho。
二．参与EMT过程控制的常见信号通路有：
1.TGF-β信号通路
2.Wnt信号通路
3.Notch信号通路
4.SMAD信号通路
5.PI3K-AKT-MTOR信号通路。
三. EMT过程有着复杂的调节网络：
表观遗传的调节
转录调节
选择性剪接
蛋白质的稳定
亚细胞定位
这些调节方式多样性使得EMT的调节往往不是线性的。此前，EMT调节过程中关于E-cadherin的转录，EMT转录因子SNAI1，SNAI2， ZEB1，ZEB1和 TWIST1等研究较多。
数据与方法
数据：comprising 122 carefully annotated biopsies from 77 patients—of 9 morphological stages of the carcinogenesis of lung SCC (stages 0–8) 。
first step：bronchial mucosa with normal histology (stages 0 and 1, which had normal and low fluorescence, respectively) and hyperplasia (stage 2), which we subsumed under the category of 'normal bronchial tissue’ the second step：metaplasia (stage 3) and mild and moderate dysplasia (stages 4 and 5), which were grouped under 'low-grade’ lesions the third step：combined severe dysplasia (stage 6) and in situ carcinoma (stage 7) into 'high-grade’ lesions the fourth step：segregated invasive (SCC, stage 8) from premalignant lesions
DEG：转换状态的样本 VS 正常组织
功能富集分析：mSigDB database的the cancer hallmark，超几何
代码：https://github.com/Precancer/SCC ；数据：GSE33479
主要结果
1.差异表达分析
ANNOVAR分析，找到4,734个基因与9个stage相关。（其它方法的差异分析也可以）
2.半监督聚类分析
然后：对差异表达基因进行热图绘制，列进行层次聚类，发现了四个主要的molecular steps。（也可以使用其它分析方法，比如时间序列）
3.WGCNA分析
性状表型应该用的是那九个stage，并对每个模块使用mSigDb数据库的cancer-hallmark gene sets进行功能富集分析。（这里的WGCNA基因模块划分，其实就类似于时间序列的表达量模式分析）
得到7个模块，有模式：
上升的模块 the 'ascending’ module，与proliferation相关 下降的模块 the 'descending’ module，与the DNA damage response相关 the 'ascending from high-grade’ module，与 immune response相关 'SCC increase’ module， epithelial–mesenchymal transition相关 biphasic， 与metabolism regulation相关
4.免疫相关基因在七大模块中的比例分析。
占比最高的是'ascending from high-grade’ module 模块，最低的是descending module 模块。
5.不同免疫细胞类型的绝对丰度分析。
然后，我们估计了不同免疫细胞类型的绝对丰度，使用CIBERSORT方法从基因表达去卷积复杂组织的细胞组成。
在高high-grade dysplasia样本中，myeloid-derived cells骨髓来源的细胞, neutrophils中性粒细胞 and macrophage subtypes 巨噬细胞亚型有增加的趋势。
6.功能富集分析
为了进一步阐明转化过程中每个分子阶段的免疫转变，我们对转化过程中与正常组织相比的差异调控基因进行了功能分析。
早期stage，下调负向调控的免疫相关基因；high stage免疫抑制相关基因显著上调。（显著的癌症特征，免疫逃逸机制？）
下面这个图很好看，我得给它搞出来。
图注：Positive fold changes in high-grade lesions and SCC compared to the corresponding normal tissue expression observed for co-stimulatory, co-inhibitory and suppressive interleukins (linear mixedeffects model of the four molecular steps adjusted for smoking history and previous cancer status as fixed effects, and patient as random effect).
7.肿瘤微环境特征描述
为了对微环境结构进行高清描述，我们在同一支气管上皮病变上使用了两个seven-plex staining panels :一个用于识别免疫细胞类型的表型面板和一个功能面板，包括PD1、PD-L1、Ki67和CD137。
免疫细胞密度计算：We calculated immune-cell densities as the number of positive cells per unit of tissue surface area (mm2)。
8.文章结果总结
(1) immune sensing and immune unleashing are induced at the earliest step of transformation
免疫感应和免疫释放在转变的最早步骤被诱导
(2) continual cell proliferation fosters the accumulation of somatic mutations, mounting an anti-tumour immune response
持续的细胞增殖促进了体细胞突变的积累，形成了抗肿瘤免疫反应
(3) inherent immune-suppression mechanisms are triggered in high-grade pre-cancerous lesions.
在高grade癌前病变中，固有的免疫抑制机制被触发。