基因敲除细胞株(系)构建步骤

CRISPR/Cas9技术可以让目的基因产生功能性缺失突变，并由此改变了科学家研究目的基因的方式。利用CRISPR/Cas9技术在单个细胞上产生一个突变来建立一个新的细胞系，也就是CRISPR介导的基因敲除克隆。这些克隆细胞系是探索蛋白质功能、分析敲除基因后的结果和研究生物试剂特异性的重要工具。然而，想要成功获取到敲除克隆，在技术上是具有一定挑战性的。在实践中，做一个基因敲除克隆并不是那么简单的。想要获得高质量和可复制的编辑细胞可能需要一定的经验和技术优化。

CRISPR基因敲除细胞株的标准工作流程，涵盖从项目设计方案到单克隆验证的五个主要步骤：

1. 设计基因敲除方案并制备敲除载体

2. 细胞转染

3. KO细胞的扩增

4. 挑单克隆细胞并扩增

5. KO验证

可想而知这个过程中会涉及到许多不同实验方法和技术，因此上述的每一步都是需要你仔细考虑并且对你的实验经验与技术操作都有较高的要求，你做好全面地学习构建KO细胞系的准备了吗？

图1：基因敲除细胞工作流程

  如何设计和构建gRNA：

gRNA可以识别靶基因区域并将Cas9引导至DNA的靶部分。对于gRNA的制作，需要设计和合成gRNA寡核苷酸序列。然后将合成的寡核苷酸克隆到合适的表达载体中并验证寡核苷酸序列。

研究人员可以用几种不同的形式去构建敲除细胞株，如单gRNA，双oligo系统的cr:tracrRNA，体外转录 RNA，质粒和慢病毒。其中，基于质粒和慢病毒的方法是最受研究人员欢迎的。但是它们耗时、需要进行筛选，并且有可能导致脱靶。但慢病毒对一些难以转染的细胞有着显著优势。此外，使用多个gRNA可以增加编辑成功的几率，并在挑克隆阶段节省下游时间。但前提是这些gRNA必须是要正确靶向靶位点的。构建敲除细胞株，首先要设计靶向目的基因的gRNA，gRNA需要克隆到合适的表达载体中并进行gRNA的序列验证。

事实上，设计gRNA需要考虑的因素比较多，对于操作者的专业能力与实验经验都有较高的要求，如果你对自己设计的gRNA没有足够的信息，可以考虑使用一些gRNA设计工具，比如红棉系统-CRISPR基因编辑设计工具，它是可用于在线设计敲除细胞株方案和gRNA的免费工具。

  细胞转染：

确定了CRISPR敲除方案之后，下一步就是选择最有效的细胞转染方法。许多研究人员认为选出最有效的转染方法是CRISPR工作流程中最困难的一步。每种细胞类型通常需要不断优化，调整转染条件以准确地将CRISPR基因编辑载体递送到细胞中。除此之外，一些细胞类型，包括干细胞，原代细胞和免疫和造血细胞谱系更难以转染，因为它们改变了细胞修复机制，降低了细胞活力。因此，想要成功转染的前提就是对目的细胞系的经验以了解细胞特征。

  挑单克隆和细胞扩增：：

挑单克隆被认为是选取一个匀质、单一的含有所需基因敲除的细胞团的最佳方法。研究人员通常使用两种常用的挑单克隆和扩增方法，一种是用极限稀释法来挑单克隆，另一种是单细胞荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）。尽管两种方法都可以达到挑单克隆和扩增的目的，鉴于FACS分选得特异性分离双阳性细胞的能力，FACS通常更有效。然而，极限稀释法比分选更便宜并且可能导致更少的细胞应激。此外，在这个阶段，研究人员应该注意细胞要处于一个完全优化的生长条件下生长，否则，它可能导致珍贵细胞样本的死亡和产生敲除细胞系的所有工作都被白费了。

对于一些细胞系来说，产生单细胞克隆是棘手的，只有少数克隆可能在分离过程中能茁壮成长。

  验证：

当构建好敲除细胞系之后，就需要对特定基因编辑进行充分验证，这是KO实验的最后一步了，也是最令人期待的一步。验证细胞KO是否成功需要对敲除细胞进行表征并确保工作的下游可行性。有多种方法可以用来验证细胞系的基因是否有被正确编辑。验证工程细胞系的常用方法包括Sanger测序，新一代测序NGS和qPCR以在基因组水平上验证编辑。蛋白质印迹WB和质谱可以在蛋白质组学水平上确认KO。对于功能研究，经常使用免疫组织化学，免疫细胞化学和FACS。如果你在基因水平，蛋白质水平和功能水平上都得到了预期的结果，那真的要好好恭喜你了！因为在一般情况下，在蛋白质水平上的验证往往不如人意，但是想发高分文章却常常躲不掉这一步，因此能100%保障WB结果成功是来评价一个细胞敲除服务的关键指标。