病毒准种定量分析：评估慢性HBV感染免疫耐受期的新方法
陈立 张欣欣
上海交通大学医学院附属瑞金医院
编者按：如何从慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者中准确区分免疫耐受期（IT）患者，这对于慢性乙型肝炎（CHB）抗病毒治疗等临床决策至关重要。然而，目前无创诊断模型研究仍较少涉及该问题。我国上海交通大学医学院附属瑞金医院张欣欣、陈立教授团队经过多年的潜心研究，终于摸索出一套能够准确评估慢性HBV感染免疫耐受期的新方法——病毒准种定量分析。该项研究成果已发表在Emerging Microbes & Infections杂志（影响因子：7.163）。本刊特邀请张欣欣教授、陈立教授为广大读者分享该项研究成果，并解说病毒准种定量分析的潜在临床应用价值。
本研究将二代测序技术（NGS）与机器学习算法相结合，旨在利用病毒准种特征开发一个全新的精准诊断模型。研究共入组290例HBeAg阳性的慢性HBV感染者，将其分为训练集（n=148）和验证集（n=142），然后抽提外周血的HBV DNA并使用NGS技术检测HBV准种（见图1）。
图1.研究设计图
使用本课题组自主开发的QAP病毒准种分析软件，首次实现病毒准种的操作分类单元（OUT，出自细菌宏基因组学分析的一种计算方法）定量，并通过层次聚类（HCA）和主成分分析方法（PCA）将病毒准种定量与临床表型进行关联分析，最后通过KNN、RF、SVM等机器学习方法建立IT患者的精准诊断模型。
本研究基于肝组织学结果共入组90例IT及200例CHB患者，通过HBV全基因组测序分析发现，在BCP/PreC区的病毒准种特征与肝脏炎症及纤维化程度密切相关。聚类分析发现该区段的准种特征可以将患者显著分为IT和CHB两组（图2）。
图2.聚类分析显示BCP/PreC区的病毒准种特征可将患者显著分为IT和CHB两组
据此建立的诊断模型鉴别IT或CHB患者的效能显著优于现有的HBsAg定量、APRI、FIB-4等指标（图3），且病毒定量指标与肝纤维化及炎症等级密切相关。综上，本研究基于病毒准种定量开发了一种新型的IT患者诊断模型，对于慢性HBV感染患者的个性化诊治具有较好的临床应用价值。
图3.比较基于病毒准种特征构建的RF、SVM和KNN三种预测模型与HBsAg定量、APRI、FIB-4等指标在鉴别IT或CHB患者中的效能
近年来，关于慢性HBV感染IT的研究再次成为热点问题。关于IT的定义、诊断、评估和治疗等话题均引起了诸多专家、学者的广泛讨论。现阶段，AASLD指南和APASL指南关于IT的定义基本一致，即HBeAg阳性，HBV DNA高载量（>107 IU/mL），ALT持续正常，肝脏病理组织学没有或仅有轻微炎症而无纤维化。而EASL指南则放弃了IT的提法，转而称之为HBeAg阳性慢性HBV感染。
临床上判断IT的关键之一是肝脏病理组织学，然而由于肝穿刺的有创性限制了检查的广泛开展。因此，临床学者提出了许多无创诊断方法和模型，诸如肝脏瞬时弹性硬度测定、FIB-4和APRI等等。然而，这些方法和模型往往在判断进展期肝纤维化比较有优势，而在判别IT方面的敏感性和特异性均较低，并且该诊断技术尚且存在一定的诊断灰区，因此迫切需要更加灵敏特异的诊断方法来精准判断IT患者。
我们团队长期致力于HBV病毒准种的研究，在生物信息学与准种结构特征分析方面积累一定的前期基础。在本研究中，我们与复旦大学附属华山医院张继明教授团队合作，借鉴了细菌宏基因组学分析中OTU的概念，首次在深度NGS中获取的HBV病毒序列中实现了可定量的准种分析方法。其次，这项研究通过在290例接受肝活检的HBeAg阳性慢性HBV感染队列中，应用机器学习方法，准确区分了IT和免疫清除期患者，诊断特异性超过了90%，诊断效能明显优于现有的无创诊断方法和模型。
除此之外，我们在这项研究中还发现，IT和免疫清除期患者的病毒准种序列在聚类分析中存在一定的重合区域。这提示我们有一部分IT患者可能正处于向免疫清除期的过渡阶段，这一结果加深了我们对慢性HBV感染自然史的认识。
目前我们已经开发了准种定量分析的软件包，正在开发临床应用检测平台，未来有望通过高通量一站式的液体活检，快速准确地判断IT，更好地指导临床抗病毒治疗，并减少肝穿刺活检的需求。
相关链接：Wang M, Chen L, Dong M, et al. Viral quasispecies quantitative analysis: a novel approach for appraising the immune tolerant phase of chronic hepatitis B virus infection. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):842-851.
（来源：《国际肝病》编辑部）