【LorMe周刊】有的放矢：群体感应淬灭靶向控制土传青枯病

作者：张耀中，南京农业大学博士在读。主要研究青枯菌多态性与动态阻控。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本周期刊介绍了3-OH MAME结构类似物对青枯菌模式菌株OE1-1的群体感应抑制活性的影响。原文于2020年发表在《ACS Chemical Biology》上。

导读

青枯菌可引发作物“土传青枯病”，严重威胁农业安全生产。在侵染的过程中，青枯菌们为了形成种群优势，团结在一起，群体作战，并服从“中央指挥部”——群体感应系统的安排！群体感应系统通过关键信号的传递调控青枯菌的毒力相关行为，如胞外多糖（EPS）、次级代谢产物的产生、生物膜的形成和细菌运动性等。因此，通过干扰或破坏其群体感应系统（即群体感应淬灭），从内部瓦解“中央指挥部”功能、截断传导信号，可能是控制土传青枯病的一种有效途径。

  科学问题

利用群体感应信号分子结构类似物作为抑制剂能否有效干扰青枯菌的群体感应系统，进而控制其毒力行为？如果能？其作用机制如何？是否具有特异性？

研究思路

为了回答上述问题，作者以青枯菌OE1-1为研究对象，从群体感应（QS）系统抑制剂的设计与合成到功能评价，系统探究QS信号抑制剂的作用机理。初步筛选了一组可抑制菌株OE1-1生物膜形成的QS信号类似物，命名为抑制剂PQI-1。随后，评估了PQI-1其它衍生物（PQIs-2-5）对青枯菌QS系统的抑制能力。研究发现PQIs-2-5不仅可以抑制青枯菌生物膜的形成，还抑制了ralfuranones和EPS的产生。此外，RNA-Seq分析显示，PQIs能有效抑制OE1-1菌株中群体感应依赖性基因的表达。这些抑制剂可以减轻已感染OE1-1菌株的番茄枯萎症状，同时对根际其他细菌正常的群体感应系统无影响。所以，最后作者提出特异性抑制细菌群体感应系统可能是防控细菌性枯萎病的有效途径。

主要结果

一、3-OH MAME类似物抑制菌株OE1-1的生物膜形成

前期研究发现，青枯菌模式菌株OE1-1能够产生3-OH MAME作为其群体感应信号分子，而突变菌株ΔphcB不能产生3-OH MAME，同时其生物膜产量也低于野生型菌株，这表明OE1-1菌株的生物膜形成与其phcBSRQ有关。

预测3-OH MAME的结构类似物可以抑制群体感应信号3-OH MAME与其可能的受体组氨酸激酶PhcS的结合。为了验证这一假设，作者合成了几种3-OH MAME类似物（图1A；3-12），并评估了类似物在抑制OE1-2菌株生物膜形成的能力。结果显示，PQI-1对OE1-1的生物膜抑制作用最强（图1B）。通过分析比较3-OH MAME类似物的结构特征和抑制能力，作者预测3-羟基甲基酯部分、苯环和酰基链长对群体感应抑制能力十分重要。

图1 3-OH MAME类似物对OE1-1菌株对phc QS依赖性生物膜形成抑制能力

随后作者针对抑制活性最高的3-OH MAME类似物PQI-1进行了研究。将PQI-1分解为两个亚结构（苯环和脂族酯），以此合成了19种PQI-1衍生物（图2A；13–31）。此外，还合成了4种2-羟基型类似物（图2A；32-35）。对这23种化合物进行了OE1-1生物膜测定（图2B），结果显示，将卤素（特别是Cl）或甲基引入苯环的对位可有效抑制OE1-1菌株生物膜的形成。此外，衍生物的不同酰基链长度也会影响对生物膜的抑制能力。但这些群体感应抑制剂并未显着抑制OE1-1菌株的生长（图2C），因此对生物膜形成的抑制不是由于细菌细胞的减少所致。

图2 PQI-1类似物对菌株OE1-1的phc-QS依赖性生物膜形成的抑制能力

二、群体感应抑制活性取决于PQIs的绝对构型

接着，选择化合物15、32、20和35（PQIs-2-5）进行进一步的实验（图2A）。结果显示，PQI-2与PQI-4的（R）-对映体表现出比其（S）-对映体具有更高的抑制能力（图3A和B）。PQI-3与PQI-5的（S）-对映体比其（R）-对映体具有更高的抑制能力（图3C和D）。尽管3-OH MAME与PhcS如何相互作用的细节尚不清楚，但竞争或拮抗配体的羟基的立体化学结构能会影响其与PhcS的结合亲和力。因此结果表明：PQIs的羟基基团位置（C-2和C-3）的绝对构型是影响其群体感应抑制活性的重要因素。

图3 对映体（R/S）-PQIs化合物对OE1-1菌株生物膜形成的抑制活性

三、PQIs抑制青枯菌毒力相关因子的表达

Ralfuranones，即芳基-呋喃酮次生代谢产物，可能作为次生细胞间信号起作用，并在菌株OE1-1的毒力表达过程中发挥重要作用。其生物合成基因ralA / ralD的表达受phc QS系统调节。如果PQIs-2-5能抑制菌株群体感应系统则还应抑制OE1-1菌株中ralA / ralD基因的表达和ralfuranones的产生。为了检验这一点，作者构建了一种对ralfuranones A定量测定，评估PQIs-2-5对ralfuranones合成的影响。结果显示，PQIs-2-5有效抑制了菌株OE1-1的ralfuranones A的产生（图4A），但一些特定浓度和构型的PQIs-2-5会对ralfuranone A的合成表现出部分正向作用，（S）-PQI-3和（S）-PQI-5对ralfuranones A生成的抑制作用高于（R）-PQI-2和（R）-PQI-4。

同样EPS I是青枯菌EPS的主要组成部分，被认为是青枯菌最重要的毒力因子。Phc QS系统严格控制其生物合成基因簇的表达。因此，作者研究了PQIs是否抑制菌株OE1-1中的EPS I产生。结果显示，PQIs-2-5以10和100μM抑制EPS I产生（图4B）。这些结果表明：PQIs-2-5有效抑制了OE1-1菌株对群体感应依赖的毒力因子的产生。

图4 PQIs-2-5作为phc QS抑制剂

四、PQIs是3-OH MAME的竞争性拮抗剂

由于PQIs的构型是基于3-OH MAME的结构合成，因此PQIs可以充当3-OH MAME与PhcS结合的竞争性拮抗剂。为了对此进行检验，作者使用菌株OE1-1对PQIs-2-5与3-OH MAME进行了竞争性生物膜形成试验。结果显示，3-OH MAME以剂量依赖的方式阻断了PQIs的抑制作用（图4C）。结果表明：PQIs-2-5在OE1-1菌株中充当3-OH MAME的竞争性拮抗剂。

五、PQIs对OE1-1菌株的RNA-Seq转录组分析

除了调节毒力因子外，phc QS系统还调节RSSC的许多代谢和细胞特性。作者为了评估PQIs-2-5的作用，利用RNA-Seq分析菌株OE1-1的转录组。结果显示，添加抑制剂PQIs后OE1-1相关基因的表达量与突变株ΔphcB基因表达呈现正相关的关系（图4D）。在388个群体感应阳性基因中，PQIs抑制了350–371个基因的表达，包括ralfuranone生物合成基因（ralA和ralD）和EPS I生物合成基因（eps簇）。另一方面，在131个群体感应阴性基因中，109-128个基因被PQI上调，包括趋化性相关基因（motAB和cheAY）和鞭毛运动相关基因（flgN和flhF）。RNA-Seq转录组分析结果表明：PQIs-2-5对phc QS回路信号的具有抑制活性作用。

六、PQIs抑制青枯菌感染番茄枯萎病

为了调查了PQIs-2-5是否能减弱番茄植物OE1-1的毒力，作者通过根浸法接种OE1-1菌株，并添加不同浓度的PQIs-2-5。结果显示，PQIs以剂量依赖的方式显着抑制了侵染的番茄植株中枯萎症状的表达（图5A）。在PQIs中，PQI-5的抑制作用最强（图5A和B）。添加3-OH MAME阻断了12.5 μM PQI-5的青枯病抑制作用（图5C），表明PQI-5的体内抗毒活性受抑制phc QS系统调控。因此，PQI-5可以抑制OE1-1细胞扩散到番茄植物的地上部分。结果表明：PQI-5和其他PQIs通过与3-OH MAME与PhcS的竞争性结合而减弱了OE1-1菌株的毒力。

图5 PQIs-2-5对番茄的OE1-1毒力的减弱及其在AHL-QS系统上的作用评估

七、PQIs不影响正常的AHL型群体感应系统

生活在植物根际中的细菌也具有群体感应系统，在维持其生态位方面可能起重要作用。为此，作者使用了两种指示菌株，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）NTL4（pZLR4）和紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）CV025来验证PQIs2-5是否对其它微生物产生影响。根癌农杆菌（pZLR4）具有报告基因traG-lacZ基因，响应于带有中/长酰基链的AHLs（高丝氨酸内酯）产生β-半乳糖苷酶，而当带有短/中间酰基链的AHLs出现时，紫色色杆菌CV025产生了紫色素。结果显示，PQIs-4均未抑制指示菌株群体感应系统（图4D和E）。此外，作者观察到即使使用浓度比天然刺激剂AHLs高100-1000倍，PQIs对群体感应系统没有拮抗作用，对报告菌株生长无抑制作用。因此结果表明：PQIs-2-5不会影响宿主根际中细菌的正常的群体感应系统。

 结论   

本文发现3-OH MAME类似物PQI-1能够作为群感效应抑制剂抑制模式青枯菌OE1-1毒力因子的产生，进一步发现PQI-1类似物PQIs-2-5也具有相同的抑制作用，但这些物质并不影响病原菌的生长。同时，PQIs并不影响根际其他微生物群体感应，这对于精准阻控病原微生物具有重要意义。

论文信息

原名：Quorum SensingInhibition Attenuates the Virulence of the Plant Pathogen Ralstonia solanacearum Species Complex

译名：群体感应淬灭减弱植物病原菌青枯菌毒力

期刊：ACS Chemical Biology

IF₂₀₂₀：4.3740

发表时间：2020年10月

通讯作者：Kenji Kai

通讯作者单位：大阪府大学生命与环境研究生院