科研 | Nature：巨噬细胞源的谷氨酰胺促进卫星细胞活化和肌肉再生
编译：张娜，编辑：Tracy、江舜尧。
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肌肉再生是通过巨噬细胞浸润并激活卫星细胞来实现的。巨噬细胞和卫星细胞以不同的方式进行信息传导，但它们之间的代谢相互作用尚未阐明。我们发现，在小鼠模型中，肌肉损伤和老化的特征在于组织中谷氨酰胺被限制。低水平的谷氨酰胺会增强巨噬细胞谷氨酰胺合成酶（GS）的活性及其分泌谷氨酰胺的代谢能力，但这些都须以谷氨酸脱氢酶1（GLUD1）介导的谷氨酰胺氧化为前提。此外，在巨噬细胞中敲除Glud1可增强GS的活性，防止谷氨酰胺缺乏。我们还发现，卫星细胞通过谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5摄取巨噬细胞源的谷氨酰胺，可激活mTOR，促进了卫星细胞的增殖和分化。因此，巨噬细胞中特异性缺失或药理抑制GLUD1可改善肌肉再生和功能恢复，以应对急性损伤、缺血或衰老。但是，卫星细胞中SLC1A5阻滞或巨噬细胞中GS失活对卫星细胞功能和肌肉再生有负向调节作用。这些结果表明了卫星细胞和巨噬细胞之间的代谢相关性，其中巨噬细胞源的谷氨酰胺可维持卫星细胞的功能，因此，以GLUD1为靶向的治疗可促进受伤或老化的肌肉再生。
论文ID
实验设计
实验结果
巨噬细胞有助于修复受损的骨骼肌，它们可清除组织碎片并释放刺激卫星细胞增殖的生长因子；随后，它们再促进卫星细胞分化和组织血管再生。研究表明，巨噬细胞耗竭可损害肌肉组织再生能力。
为了诱导肌纤维死亡、炎症和肌肉再生，我们在对照组小鼠和Glud1敲除小鼠中，将心脏毒素（CTX）注射到胫骨前肌或小腿部肌肉引起缺血。对照组和Glud1敲除小鼠在健康条件下和损伤后早期(注射心脏毒素后一天或结扎股动脉后三天)显示出了相似的肌肉组织学(图1A-e)。然而，与对照组小鼠相比，Glud1敲除小鼠的再生肌纤维数量高峰到达更早，肌肉坏死、细胞死亡、氧化损伤和炎症的消退速度更快(图1A-m)；注射CTX 6天后，Glud1敲除小鼠肌肉活力高于对照组。然而，在Glud1敲除小鼠中，早期再生的肌纤维较少，而晚期再生的肌纤维较大，这表明Glud1敲除小鼠的再生速度更快，再生程度更高(图1n-p)。
图1 巨噬细胞中GLUD1缺失促进卫星细胞激活和肌肉再生
a-d，（a）CTX注射后肌肉坏死；（b）再生；在第6天用苏木精和伊红（H&E）染色，显示坏死（黑色虚线）（c）再生（黄色虚线）纤维（d），e，f，结扎后14天坏死（e）和再生区（f）。g-i，（g）CTX 注射后TUNEL染色显示肌肉凋亡情况；CTX注射第6天的显微照片（h）和结扎后(i).j，氧化应激由二氢钛（DHE）染色CTX注射第6天后或结扎后14天。k-m，炎症。（k）CTX注射后F4/80巨噬细胞浸润；第6天（l）和结扎后(m）；n，CTX注射6天后肌肉活性（2，3，5- 三苯基-氯化四氧化二醇（TTC）染色）。o，p，CTX注射6天后（o）的早期再生肌纤维（左）和晚期再生肌纤维（右）代表性的显微图（p）。q，转轮实验（n=5）。r，s，Pax7（r）和Myog CTX注射后（s）的的肌肉提取物逆转录qPCR（RT-qPCR）；t，u静止（pHH3−）和增殖（pHH3）卫星细胞在Baseline和CTX注射后1天（t）或结扎后3天（u）代表性的免疫荧光图，白箭头：PAX7或PAX7+pHH3+细胞;黄色箭头，Pax7+phh3−细胞；V-x，PAX7（v）、MYOD（w）和MYOG（x）的肌肉提取物Westernblot。至少两个独立的实验。应用非配对t检验、ANOVA）进行分析。数据以均值±s.e.m.表示。
在转轮测试中，两种基因型小鼠的基线物理活动及其在CTX注射后一天均下降，但是，Glud1敲除小鼠比对照小鼠更早恢复受伤前的身体能力（图1q）。
然后我们通过检测PAX7的表达评估不同基因型的卫星细胞基础数量（图1r-v），发现损伤后，Glud1敲除鼠中卫星细胞增殖更明显和分化速度快（图1r-x）。因此，Glud1敲除鼠中肌肉再生更为有效。
接下来，我们评估GLUD1缺乏如何影响巨噬细胞介导的免疫调节和血管生长。在Glud1敲除鼠中，早期的血细胞计数、肌肉中免疫和血管特征与对照组相似，两种基因型的体外和体内募集试验和巨噬细胞极化，以及伤口愈合和血管生成功能没有差异。然而，在损伤后，Glud1敲除鼠中M2样巨噬细胞较少，这表明在Glud1敲除鼠中，炎症可以更快被清除并引发更高效的肌肉修复。
细胞内的代谢变化可以影响邻近细胞的生物学。与富含谷氨酰胺相比，谷氨酰胺减少时，野生型巨噬细胞中谷氨酰胺的氧化降低73%（图2a）。与野生型细胞相比，在两种培养条件下，GLUD1敲除巨噬细胞中的谷氨酰胺氧化率均较低（图2a）。而且，它们之间的总2-氧化葡萄糖酸盐（2-OG）的水平也存在差异，可能是由于增强的柠檬酸循环增强（图2b），从而弥补了谷氨酰胺衍生碳的缺失。
图2 卫星细胞摄取巨噬细胞来源的谷氨酰胺促进肌肉再生
a，b，在谷氨酰胺(Q)丰富和谷氨酰胺降低条件下，谷氨酰胺氧化(a)和丙酮酸-羧化酶活性(b)；c,d,谷氨酰胺饥饿条件下(c)和L-蛋氨酸-S、R-亚磺胺(MSO)介导的GS抑制条件下(d)，骨髓巨噬细胞(BMDM)内外谷氨酰胺的水平；Western blots：BMDM中GS(e)和GLUD1(f)的水平；g,谷草转氨酶(BCAT)、谷草转氨酶(GOT)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性。h-j，总谷氨酰胺，[13C5，15N2]谷氨酰胺和[13C0，15N0]谷氨酰胺分别刺激C2C12细胞(h，j)和BMDM(i，j)，单独接种或与[13C5,15N2]谷氨酰胺共培养(n=3)；k，l，注射CTX后1d (K)或结扎后3d(L)谷氨酰胺水平；m-o, CTX注射1天后谷氨酰胺和卫星细胞的增殖（m，n）和CTX注射6天后坏死（o）；p，野生型巨噬细胞(左)、间质谷氨酰胺(右)的谷氨酸向2-氧化葡萄糖(GLUD1活性；红线)和谷氨酰胺向谷氨酰胺(GS活性；黑线)的转化。U，酶活性单位；q、r、C2C12与BMDM共培养；s，Western blots检测分离的卫星细胞中磷酸化p70S6K(注射CTX后1d)和磷酸化S6(注射CTX后3d)。t-y，用野生型和Glud1基因敲除骨髓重组的小鼠注射环磷酰胺后6天，免疫荧光染色(t)、EDU肌核(u)、MYOD核(v)、成肌细胞融合(w)、再生肌纤维面积(x)和坏死(y)情况；z，GPNA介导的SLC1A5抑制后，注射CTX后1d pHH3+卫星细胞数量。
虽然GLUD1敲除的巨噬细胞中的谷氨酰胺氧化作用有所减弱，但细胞内和细胞外谷氨酰胺的产生较多，这是由于GS活动增强（图2c，d）。在蛋白质水平上，低谷氨酰胺条件下野生型巨噬细胞可诱导GS，但在GLUD1敲除的巨噬细胞中，GS活性更强（图2e）。
GLUD1 将谷氨酸转化为2-OG，GS催化谷氨酸生成谷氨酰胺。当谷氨酰胺水平较低时，野生型巨噬细胞中的GLUD1蛋白水平也上调（图2f）；当谷氨酰胺缺乏时，野生型巨噬细胞中葡萄糖转化为谷氨酸的能力增强，在GLUD1敲除的巨噬细胞中更是如此。在没有GLUD1的情况下，巨噬细胞可通过增加分支链氨基酸氨转移酶（BCAT）的活性使2-OG转化为谷氨酸，或增加谷氨酸-牛甲酸酯转氨酶（GOT）活性（图2g）。但是，只有下调细胞质BCAT（BCAT1）时，GLUD1敲除的巨噬细胞才能将谷氨酰胺恢复到正常水平。
为了探究巨噬细胞源谷氨酰胺的去向，我们将C2C12肌细胞和巨噬细胞共培养。结果表明，与C2C12肌细胞单独培养相比，野生型或GLUD1敲除的巨噬细胞共培养体系中肌细胞内总谷氨酰胺水平降低较低（图2h）；在GLUD1敲除的巨噬细胞中，总谷氨酰胺的细胞内水平较高（图2i）。因此，我们认为GLUD1敲除的巨噬细胞中谷氨酰胺生产超过谷氨酰胺的消耗量，从而增加了肌细胞的谷氨酰胺利用率。
在体内基线条件下，对照组和Glud1敲除鼠的肌肉中质谷氨酰胺的水平相似，但在损伤条件中下调（图2k，l），而谷氨酸水平没有变化。巨噬细胞中，GS耗尽可加剧损伤后谷氨酰胺短缺，Glud1敲除的巨噬细胞也无法维持谷氨酰胺的水平（图2m）；同样，巨噬细胞特异性的GS缺失会促进损伤后卫星细胞的增殖和肌肉愈合(图2N，o)。因此，巨噬细胞GS在补充谷氨酰胺和促进卫星细胞激活以应对肌肉损伤方面发挥重要作用。
与上述数据一致，我们在低谷氨酰胺条件下培养野生型巨噬细胞。结果显示谷氨酸向2-OG的转化减少，而2-OG转化为谷氨酸和谷氨酸转化为谷氨酰胺的能力增强。我们又从CTX损伤的野生型小鼠的肌肉中分离巨噬细胞，结果显示，随着时间推移，GS活性逐渐增加，氧化GLUD1活性逐渐减少（图2p，左），导致间质谷氨酰胺缓慢增加（图2p，右）。GLUD1敲除鼠中，肌肉浸润的巨噬细胞GLUD1活性更低，GS活性更高，可防止损伤后间质谷氨酰胺下降（图2k）。
随后，我们探讨了巨噬细胞来源的谷氨酰胺对C2C12肌细胞的再生潜能的影响。为此，我们通过将C2C12肌细胞区分为富含谷氨酰胺和只含一定谷氨酰胺的培养基来观察肌管的形成（图2q，r）。在富含谷氨酰胺的培养基中，C2C12细胞与野生型巨噬细胞共培养可减少成肌分化；而C2C12细胞与GLUD1敲除巨噬细胞共培养可产生更多的肌管，这与培养基中谷氨酰胺的水平无关（图2q，r）。C2C12细胞中敲除SLC1A5会减少谷氨酰胺的摄取，并抑制GLUD1敲除巨噬细胞促进肌细胞分化的作用。GLUD1敲除巨噬细胞培养基中增殖标志物PCNA和分化标志物myogenin表达增加，并以谷氨酰胺依赖的方式激活了mTOR通路。mTOR通路在卫星细胞的增殖和分化过程中发挥重要作用。mTOR抑制剂Torin2可抑制共培养体系C2C12细胞中PCNA和myogenin的表达。同样，CTX注射Glud1敲除鼠，其卫星细胞中mTOR通路也增强（图2s）。
在谷氨酰胺充足条件下，SLC1A5敲除卫星细胞的体外增殖和分化受到抑制。因此，我们向LSL-Cas9/Pax7creERT鼠注射靶向slc1a5的gRNA AAV8颗粒，在该小鼠的PAX7+细胞中CTX诱导Cas9表达。从而使所有卫星细胞中SLC1A5选择性下调60%。骨髓移植实验表明，GLUD1敲除巨噬细胞能改善卫星细胞介导的小鼠肌肉再生，我们在CTX注射后24小时施用5-乙基-2-脱氧核糖核酸（EdU），并在5天后收集损伤的胫骨前肌。与野生型骨髓重组小鼠的肌肉相比，用Glud1敲除骨髓重组小鼠的肌肉显示出更多EdU+终末分化的肌细胞核和MyoD+成肌细胞，并且再生肌纤维面积增加（图2t-x）。相反，当卫星细胞导入谷氨酰胺的能力受到抑制时(使用靶向slc1a5的gRNA)，glud1敲除鼠的肌肉再生被抑制（图2t-x）。
与肌肉再生的结果类似，在对照组小鼠和Glud1敲除小鼠中，接受非靶向gRNA治疗的Glud1敲除小鼠组织损伤较轻，但SLC1a5 gRNA治疗的Glud1敲除小鼠组织损伤较重(图2y)。由于野生型卫星细胞的数量增加发生在CTX注射后的第2天到第4天(图1R)，所以我们使用EdU治疗了3天。EdU治疗3天后，EDU+肌核的数量比24小时肌核的数量要多得多，当卫星细胞的谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5被抑制时，EDU+肌核的数量显著减少。此外，我们还发现，SLC1A5抑制剂γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(GPNA)对CTX处理的Glud1敲除鼠和野生型小鼠的卫星细胞增殖都有抑制作用(图2Z)。综上所述，卫星细胞摄取巨噬细胞源的谷氨酰胺在调控肌源性功能中具有重要作用。干扰该环节不仅能抑制Glud1敲除小鼠的肌肉修复，还能延缓对照组小鼠的肌肉再生。
众所周知，再生功能会随着年龄的增长而下降。与年轻小鼠相比，18个月大的对照组小鼠的肌肉重量指数降低，但Glud1敲除小鼠的肌肉重量指数下降不明显(图3a)，并且有更大的肌纤维(图3b，c)，间质谷氨酰胺也存在同样的趋势(图3d)。相对于年轻对照组小鼠，老年对照组小鼠中纤维化和巨噬细胞浸润加剧，但在Glud1敲除小鼠中程度较轻(图3e-g)，这表明慢性炎症与肌肉健康呈负相关。总的来说，与18个月大的对照组小鼠相比，18个月大的Glud1敲除小鼠肌肉状态较好(图3h-j)。并且，Glud1敲除鼠肌肉中卫星细胞数量增加，但磷酸化p38+/磷酸化p38-卫星细胞比率降低(图3k-m)；这表明Glud1组小鼠中卫星细胞的自我更新能力较强。
图3 巨噬细胞中GLUD1下调有利于受损和衰老的肌肉
a，腓肠肌重量。b、c,腓肠肌切片H&E染色，纤维面积定量(b)和H&E染色图片(c)；d，胫骨内-前间质谷氨酰胺；e，f，Masson’s三色染色(f)测定老年小鼠小腿肌胶原蛋白沉积(蓝色)及其定量(e)。幼年和老年小鼠小腿肌肉巨噬细胞浸润情况。h-j，抓力测试(h)、转杆试验(I)和转轮试验(j)；k，胫骨内-前部卫星细胞密度；l，m，PAX7和磷酸化P38在卫星细胞中与老年小鼠趾长伸肌分离的肌纤维有关。注射CTX后6d或结扎后14d经R162介导的GLUD1抑制后出现肌肉坏死(n)，显微镜下可见缺血性坏死(o)；p，CTX注射后6d或结扎后14d巨噬细胞浸润情况。q，CTX注射后1d pHH3+和pHH3−卫星细胞。r，CTX注射后1d，间质谷氨酰胺；s-w，腓肠肌重量(s)，胫骨内-前部卫星细胞密度(t)，间质谷氨酰胺(u)，转杆试验(v)，抓力测试(w)。
最后，我们评估了GLUD1抑制剂R162的潜在治疗效果。结果表明R162治疗可减轻肌肉坏死的情况和炎症状况(图3n-p)，促进卫星细胞的增殖，并增加间质谷氨酰胺的水平(图3q，r)。在18个月大的小鼠中，服用R162一个月可增加肌肉质量、卫星细胞数量和间质谷氨酰胺水平，并改善体能(图3s-w)。而且，R162不影响体重或单个器官的重量。
肌肉组织是人体合成谷氨酰胺的主要场所。该研究发现肌肉损伤和衰老抑制了谷氨酰胺的供应，肌肉中浸润的巨噬细胞感觉到了这种不足，从而减少谷氨酰胺的氧化，有利于谷氨酰胺的产生。巨噬细胞释放的谷氨酰胺被卫星细胞摄取，通过激活mTOR通路促进其增殖和分化。与野生型巨噬细胞不同，GLUD1基因敲除的巨噬细胞预先适应了谷氨酰胺不足，因此，巨噬细胞的新陈代谢重塑有利于肌肉内环境稳态，以应对损伤。
在糖尿病、高胆固醇血症和肥胖的患者中，血管阻塞和骨骼肌损伤的风险大大增加，而且，这些疾病在当今社会越来越普遍。同样，在许多国家，随着人口平均年龄的增加，肌肉减少症的患病率也在上升。然而，目前几乎没有办法改善与并发症或年龄相关的肌肉问题。我们的数据揭示了一种治疗病理性或年龄相关性骨骼肌萎缩的新方法。