编译：微科盟萌依依，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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导读
牛奶是人类最重要的营养食物来源之一。牛奶化学成分取决于许多因素,代谢组学已成为了解乳制品化学组成和动态变化的主要方法之一。本文综述了牛乳中代谢物的变化，这些变化既与奶牛品种、产奶品系、泌乳阶段等内在因素有关，也与日粮、季节、地理来源、疾病、加工和贮存稳定性等外部因素有关；同时，本综述列出了先前研究中确定的候选生物标记物：胆碱、柠檬酸、缬氨酸、马尿酸、2-丁酮、乳酸和一些脂肪酸等可作为牛乳品质、溯源和安全性研究的生物标志物的代谢产物，还对这些候选生物标志物在牛奶真假认证中的应用进行了综述。
原名：Milk biomarkers in relation to inherent and external factors based on metabolomics译名：基于代谢组学的牛奶生物标志物与内外因素的关系期刊：Trends in Food Science and Technology通讯作者单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，奥塔哥大学牛奶作为第一食物来源，为人类提供生长和发育所需的所有营养和能量。牛奶是西方饮食的重要组成部分，在过去三十年中，世界牛奶产量增长了60%以上，从1987年的5.22亿吨增加到2018年的8.43亿吨(联合国粮食及农业组织)。此外，发达国家的牛奶消费量一直很高，由于其高营养价值，发展中国家的牛奶消费量正在增加，例如，2018年中国人均牛奶消费量为36公斤；约为世界平均水平的三分之一。如果这一消费量要增加到全球平均水平(人均110公斤)，那么将需要额外生产1.05亿吨牛奶。代谢组或代谢组学，是研究目标细胞、组织、器官或有机体中存在的低分子有机分子的科学。目标化学过程中涉及的代谢物通常通过大规模和高通量技术进行测量，包括核磁共振(NMR)和质谱(MS)。作者在Webof Science上进行了一项关于2000年到现在的牛奶代谢组学的文献调查，结果汇总在图1中。在过去的几年中，代谢组学在牛奶和其他乳制品中的应用已经增长，特别是在健康和经济效益研究方面(图1A和B)。
图1 2000-2019年(7月22日)科学网上发表的论文数(A)代谢物*或代谢物*和牛奶或乳制品(B)代谢物*或代谢物*和牛奶或乳制品(C)在B检索条件下的不同研究类别(B)代谢物*或代谢物*和牛奶或乳制品(C)在B检索条件下的不同研究类别(B)代谢物*或代谢物*和牛奶或乳制品。近年来，随着更灵敏和可靠的检测技术的发展，非靶向代谢物分析变得流行起来。已发表的关于牛奶代谢组学的论文既与内在因素有关，也与环境因素有关，如图1C所示。代谢组的影响是多方面的，包括物种和品种、泌乳阶段、季节、疾病和热应激以及饮食，其他因素还包括加工、储存和牛奶掺假。本文综述了近年来有关牛奶基质代谢组学的研究进展，并对代谢组学的研究现状进行了展望，总结和比较了来自不同研究的特征代谢物。除非另有说明，本综述中的术语牛奶是指牛/牛奶。除了这些研究论文外，我们在Web of Science上还发现了55篇关于牛奶代谢组学的综述，这些综述集中在小型乳品动物的牛奶成分、人类母乳和婴儿配方奶粉以及牛奶加工技术的影响。此外，这些综述还集中在基于NMR的分析技术、基于MS的分析技术、基于泌乳研究的“组学”、有机牛奶、乳制品消费和代谢组学研究的数据分析；然而，截至目前，候选生物标记物在牛奶代谢组学和相关研究中的应用尚未得到综述。基于这一背景，本综述的目的如下：(i)综述与内在因素有关的牛奶代谢物的浓度变化，从遗传因素(如物种和品种)到生理特性(如泌乳阶段（第2节）)；(ii)提供与其他相关外部因素有关的候选代谢物(如饲喂或其他动物技术差异、季节变化、地理来源、健康状况、牛奶加工、储存(第3节))；(iii)综述用于牛奶认证的候选生物标志物的应用(第4节)；(iv)对目前代谢组学的应用以及有限的牛奶研究文献进行评论。综上所述，这是第一篇关注牛奶代谢组学的综述论文，为寻找合适的牛奶质量、可追溯性和安全性的生物标志物提供了科学依据。牛奶是一种复杂的生物液体，由哺乳动物的乳腺产生。牛奶中的成分因遗传影响而有所不同。牛奶掺假的动机很高，因为各种奶制品的价格因动物来源的不同而有很大差异。为了开发一种强有力的技术来打击这种欺诈行为，有必要充分了解牛奶中的代谢组图谱以及不同动物来源的牛奶样本之间的差异。表1总结了由于内在因素导致浓度有显著变化的代谢物。在研究牛乳的代谢物时，奶牛的品种是一个重要的考虑因素。许多研究人员和工厂对阐明不同品种奶牛所产的牛奶之间的营养差异表现出浓厚兴趣。与西门塔尔奶牛的牛奶相比，瑞士棕色奶牛的牛奶含有较高浓度的α-氨基丁酸，但鸟氨酸含量较低；然而，这些差异可能与品种和饲料管理有关。使用基于核磁共振的代谢组学方法能将原料奶与两个奶牛品种(丹麦泽西奶牛和丹麦荷斯坦-弗里斯坦奶牛(SDM))区分开来，结果表明泽西奶牛的脱脂奶含有较高水平的肉碱和柠檬酸盐而SDM脱脂奶的胆碱含量更高。表1 牛奶代谢组学及与内在因素相关的生物标志物研究综述
Investigation1:比较研究中牛奶的种类。LMW-Mets:低分子量代谢物。Candidate biomarkers3:向上和向下的箭头“↑”、“↓”分别表示标记组(*)中代谢物含量较高或较低的一组。
此外，还有研究者报告了泽西奶牛和荷斯坦-弗里西亚奶牛乳中寡糖(OS)组成的差异，泽西牛奶含有较高水平的唾液酸化和复杂的中性岩藻糖基化OS，而荷斯坦-弗里西亚牛奶含有较高水平的较简单的中性OS，例如，N-乙酰氨基己糖和己糖乳糖。Yang等人对中国荷斯坦和泽西品种的乳代谢物也进行了的研究。他们发现，68种代谢物的子集在泽西牛奶和荷斯坦牛奶之间显示出显著的差异，荷斯坦牛奶中乳酸、醋酸、胆碱、琥珀酸和丙酮酸的相对浓度较高，而泽西牛奶中柠檬酸和甘油磷胆碱的相对浓度较高(表1)。附加相关的代谢物如羊藿酸、LysoPE、溶血磷、磷酸胆碱也被MS鉴定出来了，但这些结果并没有在这项研究中解释。泽西和荷斯坦奶牛乳中这些选定代谢物的倍数变化超过两倍，而一些代谢物在意大利北部弗里西亚奶牛和本地奶牛的牛奶中显示出不同的浓度。综上所述，胆碱和柠檬酸可以作为鉴别泽西奶牛和荷斯坦奶牛原料奶的候选生物标志物。
奶的代谢成分在不同的奶类动物中也不同，其可能会发生掺假，因为一些小型乳制品动物的奶被认为是价格更高的功能性食品。Lamanna等报告称，利用22种选定代谢物，牛奶提取物的NMR图谱可以成功地用于绵羊和牛奶的分类；然而，在这项研究中，没有给出具体的标记物来区分牛奶和羊奶。Scano等的研究表明，利用GC-MS对牛奶和羊奶中的化学性质进行了定量，并根据识别出的代谢物建立了判别分析模型，对羊奶和牛奶进行了分类，即羊奶中缬氨酸、乳酸、甘氨酸和羟基戊二酸的含量较高，而牛奶中谷氨酰胺、丙氨酸、苹果酸、果糖、葡萄糖和塔尔糖的含量较高(表1)。与荷斯坦牛乳相比，羊奶中检测到的亮氨酸、缬氨酸和丙酮酸等几种与蛋白质合成相关的代谢物水平更高。研究发现，牛乳中N-乙酰碳水化合物和柠檬酸的含量明显较高，而羊奶中醋酸的含量较高。UPLC-Q-Exactive Orbitrap质谱根据牛奶和羊奶的脂类组成进一步表征了它们之间的差异。羊奶中不饱和脂肪酸、ARA、DHA和EPA的含量均高于牛乳(表1)。氨基酸(如缬氨酸)、碳水化合物(如果糖和葡萄糖)和不饱和脂肪酸(如ARA、DHA和EPA)的含量是牛奶和羊奶的主要区别。磷脂或不饱和脂肪酸的含量可以用来区分牛奶和骆驼/马/马奶，而对山羊和绵羊等小型反刍动物的牛奶进行的代谢学研究相对较少。Andreotti、Trivellone和Motta开发了31P 核磁共振方法来表征牛奶中的磷脂和磷酸化化合物，这种方法随后被用来研究牛奶和水牛奶。然而，在他们的研究中没有发现明显的差异。与荷斯坦牛奶相比，水牛奶中琥珀酸、丙酮酸、乳酸、醋酸、亮氨酸胆碱和亚油酸的含量较低，而羟基十八碳二烯酸的含量较高。Yang等人还将牦牛奶中的代谢物与荷斯坦牛乳中的代谢物进行了比较。牦牛乳中2-(3-羧基-3-氨基丙基)-组氨酸含量较高，琥珀酸、丙酮酸、乳酸、醋酸、亮氨酸和胆碱含量较低。不同物种(包括人、牛、骆驼和马)的奶中SM、血浆蛋白原和总磷脂的不同水平也被31P核磁共振检测到。与牛乳相比，骆驼乳中的磷脂含量较高，尤其是PA、EPLAS、SM和PI；马乳中总磷脂含量低于牛乳，而LPE、PA和LPC含量高于牛乳。研究人员还研究了用来区分荷斯坦奶牛和一些非反刍动物(如骆驼和马)产奶的代谢生物标志物。骆驼和马奶中的亚油酸、油酸和十五烷酸(二十二碳五烯酸)等不饱和脂肪酸含量均高于荷斯坦奶牛。综上所述，代谢组学研究被证明是区分不同乳品样本的有效工具。氨基酸(如缬氨酸)、碳水化合物(如果糖和葡萄糖)和不饱和脂肪酸(如ARA、DHA和EPA)的含量是牛奶和羊奶的主要区别。磷脂或不饱和脂肪酸的含量可以用来区分牛奶和骆驼/马/马奶。对山羊和绵羊等小型反刍动物的奶进行的代谢学研究相对较少；然而，随着消费者需求的发展，这是一个新兴的研究领域。母乳喂养被视为新生儿营养的黄金标准，并被世界卫生组织推荐为婴儿生命第一阶段(6个月)的唯一营养来源。与牛奶相比，母乳中SM和EPLAS的含量要高得多，而PE的含量要低得多。与牛奶相比，人乳中单不饱和脂肪酸(MUFA)、长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)、PS和SM的含量较高，而饱和脂肪酸(SFA)和PE的含量较低。母乳和牛奶之间的另一个重大区别是牛奶低聚糖（BMO）的含量，低聚糖已被认为是对发育中的新生儿有各种健康益处的生物活性分子。研究发现，人乳低聚糖(HMO)是继乳糖和脂类之后的第三大固体成分，在人成熟乳和初乳中的含量分别为12-13g/L和22-24g/L。与人乳相比，牛乳中的低聚糖(BMO)含量至少降低了100倍(初乳中为1g/L，泌乳两天后明显下降)；此外，研究人员用LC-MS方法已鉴定出约30-50个BMO结构，表明其多样性远低于母乳中所特有的OS结构(>150)。简而言之，2’-岩藻糖基乳糖(岩藻糖化OS)和乳酸-N-新四糖(中性含N OS)是HMO最丰富的结构，而BMO含有更高比例的唾液酸化OS(约50%)。综上所述，考虑到脂肪组分(如磷脂)和OS的含量，牛奶和母乳之间存在实质性差异，这在生产婴儿配方奶粉时值得考虑。然而，作为生产婴儿配方奶粉的最常用配方，人乳和牛乳之间的低分子代谢物的比较还需要更多的研究。如图1所示，已有许多研究报道了泌乳阶段对乳汁生化特性的影响。由于负能量平衡，奶牛泌乳早期(长达63天)产生的乳汁与其他阶段不同。结果发现丙酮和β羟丁酸(BHBA)是能量代谢状态的有效生物标志物。此外，在泌乳早期(<70天)，磷胆碱和甘氨酸也处于不同水平。然而，BHBA和柠檬酸在整个泌乳期内保持稳定。通过使用柠檬酸盐、乳糖和磷酸糖水平的非靶向质谱技术，研究人员进一步研究了泌乳早期乳代谢物的变化，据报道，柠檬酸盐、乳糖和磷酸糖水平是造成牛奶成分测量差异的主要原因。然而，由于动物之间的生物变异性，柠檬酸或乳糖值的变化在统计学上并不显著。因此，磷酸化糖(m/z 421[M-H]-和601[M-H]-)的浓度不断降低，更适合作为泌乳早期乳代谢物进化的指示剂。研究人员还观察到一些代谢物在不同泌乳天数的奶牛乳中的值发生变化；然而，由于缺乏样本复制，没有给出关于选定代谢物变化的明确说明。在整个哺乳期，研究人员从不同泌乳天数(6-307天)采集了306个乳样，并用非靶向LC-MS进行检测。从泌乳期的前60天到最后60天，研究者观察到乳样代谢物的变化，即阳离子模式下检测到225、397、641、642m/z，负离子模式下检测到186、241、258-260、601-604m/z(表1)，在泌乳后期样品中表现出较高的强度信号，而m/z220和256(负离子模式)的数量在泌乳后期有所增加。然而，在Harzia的研究中，大多数选择的离子都没有被识别出来，整个泌乳期的生物标志物的轮廓也没有给出。最近，根据核磁共振(NMR)，研究者在200-300天泌乳天数的奶牛乳样中发现了变异。1，2-丙二醇、BHBA、丁酸、N-乙酰-X4、1-半乳糖和1-磷酸葡萄糖含量随泌乳天数的增加而降低，而N-乙酰氨基葡萄糖和胞苷-X-P的含量则随泌乳天数的增加而升高。综上所述，乳汁中代谢物的浓度在泌乳期间发生了显著变化。这种代谢物的例子有丙酮、磷胆碱、甘氨酸和一些磷酸化的糖，如乳糖磷酸、1-磷酸半乳糖和1-磷酸葡萄糖。在选择这些代谢物作为生物标志物时，应仔细考虑它们，因为它们在不同泌乳天数的牛奶中的浓度不同。关于哺乳期对乳代谢组学影响的研究大多集中在泌乳早期；然而，为了帮助营养支持和牛奶加工，充分了解整个泌乳阶段牛奶代谢物的变化也是至关重要的。表1总结了这些生物标志物，它们与动物的类型、遗传背景和哺乳期有关。因此，这些列出的代谢物在个体之间有很高的变异性，这使得解释变得困难，在调查和选择代表内在因素影响的生物标志物时，需要仔细的实验设计。除了内部因素，牛奶中的代谢物也会受到外部因素的影响，如季节、日粮、产地、健康状况、加工、储存和配方。表2总结并列出了由这些外部因素引起的牛奶代谢组变化；此外，表2还列出了用于牛奶掺假调查的牛奶生物标志物。3.1 与季节、日粮、管理和地理起源有关的生物标志物季节变化是采样和剖面分析过程中需要考虑的因素之一。一方面，新鲜牧草的植物学和化学成分在整个季节都不同，这影响了储存的牧草(干草或青贮)的营养价值。另一方面，季节间的温差，尤其是夏季的温差，对牛奶成分有影响。Collomb等人报告说，乳脂中的内源性饱和脂肪酸减少，而单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸和共轭CLA在夏季增加(草基)。在类似泌乳阶段和相同管理制度下从奶牛身上收集的牛奶被用于分析极性脂类随季节变化的规律。这项研究发现，表2中列出的六种磷脂在10月至5月的挤奶季节都呈现出出逐渐增加的趋势，并在澳大利亚维多利亚地区的秋季(5月)达到顶峰。表2 牛奶代谢组学及与外在因素相关的生物标志物研究综述
Investigation1:比较研究中牛奶的种类。LMW-Mets:低分子量代谢物。Candidate biomarkers3:向上和向下的箭头“↑”、“↓”分别表示标记组(*)中代谢物含量较高或较低的一组。虽然在实验室中可以通过严格控制其他相关因素来单独研究季节变化，但很难将这种控制设计成从农场采集的样本进行实验。因此，季节差异，以及与其他因素的交互作用，如饮食、管理和地理来源，被结合起来研究其对牛奶代谢物谱变化的贡献。在过去的几年里，人们对用不同饲料喂养的奶牛生产的牛奶差异进行了广泛的研究。在以前的报告中，常用调查研究的日粮是牧草/牧草、干草、青贮、玉米/玉米青贮和补充剂，如植物油或维生素。牛奶根据饮食和管理的不同，可以分为常规奶、有机奶和干草奶等不同类型的牛奶。传统牛奶和有机牛奶是两种类型的牛奶，它们可能有相同的牛奶来源，但价格不同。有机牛奶是由可以获得牧场和高标准动物福利的乳制品生产的。有机牛奶和常规牛奶在脂肪酸、维生素和抗氧化剂等成分方面的差异在一项综述中进行了总结。一般来说，有机牛奶中的单链脂肪酸(C15：0和C17：0)、支链脂肪酸以及一些不饱和脂肪酸，如丙氨酸、EPA和CLA含量较高；然而，关于偶链饱和脂肪酸含量的报道却是相互矛盾的，这很可能是由于收集的样品地区性特征所致。因此，表2中只列出了在不同研究中结果一致的变化。我们研究了常规牛奶和有机牛奶中维生素含量的差异。与有机牛奶相比，常规牛奶的乳脂中维生素A含量更高；然而，在Fall 和Emanuelson的研究中，并没有观察到传统牛奶和有机牛奶的维生素A含量有显著差异。这种差异的缺乏归因于瑞典传统畜群和有机畜群使用了相似的饲料，因此，有机牛奶和常规牛奶中的维生素A水平与日粮的关系比奶牛管理更为密切。常规牛奶和有机牛奶的α-生育酚和β-胡萝卜素含量均无显著差异，有机牛奶中有机酸的含量也是以前研究过的。马尿酸被确定为决定山羊饲养制度而不是生产系统的良好标记物。以绿草为主(放牧)的山羊有机奶中马尿酸含量较高；然而，目前还没有应用非靶向低分子代谢物对有机牛奶进行分类的研究报道。干草奶是由奶牛生产的，夏天只吃新鲜的草，冬天主要吃干草，辅以少量的谷物和蛋白粉。Toso等发现，从意大利东北部用不同日粮(包括干草日粮、玉米青贮日粮和草青贮日粮)喂养的奶牛收集的牛奶可以根据9种选定的VOCs进行区分(表2)。干草乳中ALA、EPA和DHA含量显著升高，硬脂酸含量显著降低。除主食外，添加植物油或维生素等添加剂可影响瘤胃代谢或酶活性，从而引起乳成分的变化。Bernard等人研究了添加葵花籽油或亚麻籽油等植物油补充剂对羊奶成分的影响。研究结果表明，添加油脂能提高乳脂含量，提高18：0、反式-Δ6-9、11-14、16-18：1反式-7、反式-9、反式-9、反式-11-共轭亚油酸和反式-8、顺式-10-共轭亚油酸的含量(表2)。他们进一步研究了这些变化的可能机制，发现这些变化与乳腺硬脂酰辅酶A去饱和酶mRNA丰度的降低无关；然而，并不是所有的反刍动物都会对饲料补充剂做出类似的反应。对山羊和荷斯坦奶牛的比较研究表明，每种反刍动物对小麦淀粉和氢化棕榈膳食补充剂的反应不同，而海藻粉在乳脂含量方面造成类似的影响。在奶牛日粮中添加合成维生素可以提高牛奶中维生素A和维生素E的含量。牛奶的成分可能会受环境因素的影响而改变，比如农场的地理位置或海拔高度。Scampicchio等应用了技术(IRMS, IRS和GC-FID)，结果发现油酸、花生酸、二十五烯酸和肉豆蔻油酸的含量因采集区域不同而不同。基于δ2H建立了LDA模型丁酸、肉豆蔻酸、棕榈酸四种脂肪酸的δ13C值油酸对乳汁样品的分离效果最好来自新西兰北部和南部的岛屿最近，核磁共振代谢指纹图谱被用于区分来自意大利不同牧场的牛奶。虽然代谢物的季节变化存在差异，但可以通过重复采样来求取平均值。Tnowi等人基于选定的生物标志物，如胆碱、蛋氨酸、马尿酸、肌酐和乳酸，建立了具有良好预测能力的模型。来自不同农场的样品之间的差异主要是由不同的日粮(青贮或干草)造成的。综上所述，牛奶中的化学成分与季节、日粮和地理来源有关。秋季收集的牛奶中磷脂含量最高。丙氨酸和马尿酸水平可作为区分有机奶和常规奶以及不同饲喂方式奶牛的生物标志物。然而，对不同生产系统的有机牛奶进行分类的生物标志物还有待于进一步研究。代谢组学方法在其他一些技术的辅助下，可以作为一种有效的方法来鉴定牛奶的地理来源。牛奶代谢物可能会受到动物健康状况的影响，如热应激和疾病。发生在奶牛身上的常见疾病是乳热病、酮病和乳腺炎，每一种疾病都会引起一系列代谢物变化。几项研究都集中在热应激引起的牛奶成分的潜在变化上。Wheelock等发现，由于基础和刺激胰岛素水平升高，脂肪组织脂质动员减少，葡萄糖利用率增加。Tian等人对热应激给奶牛带来的影响做了进一步的研究，发现了乳酸盐、丙酮酸、肌酸、丙酮、BHBA、TMA、油酸、亚油酸、溶血磷胆酸(16：0)和磷脂酰胆碱42：2等10种代谢产物可作为诊断奶牛热应激状态的潜在生物标志物。这些标志物的变化如表2所示。乳热症与能量代谢改变有关。BHBA、丙酮和乙酰乙酸酯等酮体被发现并被认为是潜在的生物标志物。Klein等人发现，可以通过甘油-磷胆碱与磷胆碱的比率(低于2.5)来预测酮症。乳腺炎是奶牛中最常见的疾病，可以通过L-乳酸脱氢酶的活性来指示，即在体细胞含量较高的牛奶中，乳酸、丁酸、异亮氨酸、醋酸和β-羟丁酸的含量增加，而马尿酸和富马酸的含量降低。综上所述，牛奶中的代谢物水平可以作为监测奶牛健康的生物标志物，特别是乳酸盐。乳酸含量异常高可能与奶牛疾病有关，这一点值得注意。3.3 与牛奶加工、储存和工艺质量相关的生物标志物牛奶加工可以延长保质期，保持牛奶的稳定性。在牛奶加工方法中，热处理被广泛用于鲜奶；然而，牛奶的成分和营养特性在与热相关的反应过程中可能会发生变化。牛奶的风味和/或营养价值可能会因美拉德反应而改变。除了牛奶和奶粉，牛奶还被加工成奶酪等其他产品。为了评估牛奶是否适合生产奶酪，研究者对牛奶凝固性进行了评估，因为凝固性与奶酪产量和质量有关。此外，一些其他成分被添加到牛奶中，以满足特定的营养要求，例如婴儿配方奶粉。凝乳是牛奶质量的一个重要特征，不同奶牛的牛奶表现出截然不同的凝乳特性。核磁共振和LC-MS/MS代谢组阐明的与凝固特性相关的代谢物是柠檬酸盐、胆碱、肉碱、乳糖和其他寡糖(例如N-乙酰乳糖胺)。在未凝固和凝固良好的牛奶中也检测到一些含量明显不同的其他离子。然而，表2中列出的这些离子需要进一步鉴定。高凝乳和非凝乳中乳酸、醋酸、谷氨酸、肌酐、胆碱、肉碱和GPC的含量有显著差异。总体而言，凝结良好的牛奶中胆碱的含量要高出2倍，因此，胆碱浓度可以作为牛奶凝固特性的指标。关于其他被检测到的代谢物，特别是肉碱的水平，结果是相互矛盾的。这种差异可能与检测方法有关，有待进一步研究。热加工乳的营养变化与加工温度和时间有关。据报道，乳果糖、羟甲基糠醛、糠氨酸、酸溶性β-LG及其组合可作为灭菌牛奶的热指示剂。表2列出了牛奶中热加工的生物标志物。此外，乳果糖被发现是最可靠的热处理指标，因为冷藏(4℃)的生奶和储存在20℃下的超高温牛奶中的乳果糖水平都保持不变。一般来说，水溶性维生素，尤其是抗坏血酸，比脂溶性维生素对热处理更敏感。一般情况下，巴氏杀菌牛奶中维生素B12、维生素E、维生素C和叶酸等维生素含量下降，而维生素A含量升高。与原料奶相比，高温处理牛奶中SFA、UFA和PUFA的总浓度保持稳定，而总CLA含量增加了5%-11%。原料奶和UHT/HTST处理的牛奶中游离脂肪酸和共轭亚油酸的含量没有显著差异。研究者用GC-MS分析了生奶和热加工奶中的挥发性化合物。与原料奶相比，HTST处理的牛奶中含有较多的十二烷基内酯，而UHT处理的牛奶中含有较高浓度的己醛、2-庚酮和庚醛。经还原杀菌处理后，脱氧鸟苷、腺嘌呤和牛磺胆酸含量下降，精氨酰脯氨酸、2-甲基丁酰肉碱、溶血磷脂酶和N-乙酰-d-氨基葡萄糖1-磷酸含量升高，但变化不大。最近，Zhang等人开发了一种基于UPLC-QTOF/MS的代谢组学方法，将UHT牛奶与原料奶和巴氏杀菌奶区分开来。表2中列出了区分UHT奶与生奶和巴氏杀菌奶的生物标志物。喷雾干燥是流行的干燥方法。在喷雾干燥过程中研究者没有发现维生素D3(胆钙化醇)的显著损失。这种赖氨酸损失可以通过控制喷雾干燥的温度条件来避免。据报道，在喷雾干燥过程之后，母乳中硬脂酸(C18：0)的含量显著增加。由于喷雾干燥在乳制品工业中起着至关重要的作用，因此有必要全面了解喷雾干燥过程对牛奶的影响；然而，关于喷雾干燥对牛奶代谢物的影响，目前还缺乏相关研究。冷冻干燥作为一种温和的干燥技术，对营养特性的损害最小，已经在一些应用中被采用，以便更好地保存或运输牛奶样品。在冷冻干燥过程中，水在冷冻温度以下直接从固相升华到汽相。尽管由于操作成本较高而没有广泛用于商业用途，但它已被证明是保存人奶或驴奶的有效方法。通过一项目标代谢物研究，研究者发现冻干产品在冻藏过程中，由于非氧化性葡萄糖在水生生物样品中的不稳定，导致冻干品中葡萄糖含量下降，然而，所有的变量，包括葡萄糖，在冻干牛奶和随后的冷冻储存中都是保守的。据报道，冷冻干燥过程导致驴奶中2-庚酮、壬醛和柠檬烯的含量显著增加。研究者利用核磁共振(NMR)和液质联用(LC-MS)研究了冷冻干燥对原料奶代谢产物的影响，在冻干牛奶中发现一些代谢物(表2)含量降低，同时，这些变化的代谢物的倍数变化大多在2倍以内，证明冷冻干燥是一种温和的牛奶干燥方法。综上所述，冷冻干燥可以有效地保护牛奶的营养特性。适当的储存条件对保护牛奶不变质至关重要。之前的研究中观察到许多代谢物的变化是储存条件的函数，并列在表2中。美拉德反应和脂质氧化，取决于热处理条件、储存温度、湿度、pH和牛奶成分，是储存期内最重要的反应途径。在巴氏杀菌牛奶和全脂奶粉的冷藏研究中，由于乳酸菌对乳脂的脂解作用，报告了脂肪酸含量的增加。在冷藏期间，巴氏杀菌牛奶中某些代谢物的浓度降低，如泛酸和丁酰肉碱，而其他代谢物(表2)浓度增加。据报道，在常温下储存的UHT牛奶中，由于残留的糖苷酶活性，N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰氨基半乳糖和半乳糖的含量增加。在在室温下储存24周，超高温牛奶中的糠氨酸含量增加而牛血清白蛋白含量下降。此外，超高温牛奶中的糠氨酸含量也显著增加，而超高温牛奶中的半乳糖基-β-吡喃酮的含量在前30天增加，之后在23℃下储存90天期间保持不变。研究者观察到赖氨酸丙氨酸水平在UHT牛奶储存过程中有不同的增加趋势，这取决于直接/间接UHT处理。新鲜喷雾奶粉中的单糖组分，包括葡萄糖和半乳糖，在储存过程中随着塔格糖和3-脱氧五硫糖的形成而增加。研究发现，在蛋白质含量为80%的浓缩乳蛋白中，糠氨酸、游离羟甲基糠醛和褐变的含量增加，而蛋白质浓缩奶粉中的溶解度在储存过程中(25-40℃)下降。喷雾干燥牛初乳在贮藏过程中的硫代巴比妥酸(TBA)和羟甲基糠醛（HMF）含量升高，IgG含量下降，储存在4℃和-20℃的冻干奶粉表现出稳定的代谢体，而储存在20℃的样品则发生了明显的变化。冻干奶粉在224天的贮藏过程中，口香酸、核黄素和乙酰碳水化合物的含量降低，而脂肪酸、苏氨酸和尿苷的含量增加。因此热力学标志物须考虑储存条件仔细测量，以免误导结果。根据目前的研究，乳果糖可以作为超高温牛奶的处理剂，而糠氨酸则不能衡量超高温牛奶在室温储存过程中的变化；同样，2-丁酮也可以被视为巴氏杀菌治疗的生物标志物。脂肪酸、维生素和碳水化合物的含量对牛奶的加工和贮藏过于敏感，不适合作为稳定的生物标志物。据报道，牛奶是最常见的掺假食品之一，掺假不仅会造成经济损失，还会给消费者带来潜在的健康风险。牛奶掺假有不同的类型，如牛奶用水稀释或劣质牛奶，通过添加固体或蛋白质或有害化学物质来增加营养成分来生产低值牛奶，甚至直接将低值牛奶冒充为高价值产品。只要选择了适当的生物标志物，采用成熟的模型，牛奶代谢组学研究可为牛奶掺假检测提供良好的分析平台。
表1和表2中列出的生物标志物受环境条件和牧场技术系统的影响，可以用来建立判别模型，用于牛奶认证。FLD模型在通常使用的掺假范围(2-10%，v/v)内表现良好，研究者可以利用NMR根据选定的生物标记物将羊奶与牛奶或豆奶区分开来。Monakhova等人建立了一个基于SIMCA方法的模型，根据核磁共振(NMR)的牛奶代谢物区分乳糖牛奶、无乳糖牛奶和一些牛奶替代品，这被证明是验证营养标签的有效筛选工具。重组奶是将奶粉按一定比例重新溶解在水中，然后通过加压处理等牛奶加工过程使其均匀、稳定的过程。核磁共振用于区分重组奶和UHT奶，以肉碱、琥珀酸、醋酸等生物标志物为基础，建立了PLS-DA模型，预测效果良好(表3)；此外，还建立了一个内部验证模型，将牛奶中的代谢物(包括26种脂肪酸、视黄醇和生育酚的两种异构体α-和γ-生育酚)联系起来，以确定一年、夏季或冬季的采奶季节。基于快速近红外光谱技术建立的判别模型对采奶季节的预测能力较好，冬季样本的预测率为93%，夏季样本的预测率为89%。在婴儿配方奶粉中作为一种类似于人类母乳脂质的成分。研究者利用31P核磁共振谱对婴幼儿配方奶粉中的磷脂进行比较，发现不同品牌的奶粉中PE、SM和PA的含量存在差异。总体而言，牛奶代谢组学分析已被证明是检测几种不同类型牛奶掺假的有力工具。结合多种代谢物的分析，借助适当的统计判别模型，为准确、快速地筛选牛奶样品提供了保证。本综述全面总结了代谢组学在牛奶研究中的应用，包括与内在和外在因素相关的潜在生物标志物(表1和表2)以及牛奶认证(表3)。牛奶代谢组学的研究已经被证明是更好地了解牛奶特性的一种有前途的有效工具。此外，在化学计量学工具的辅助下，基于牛奶代谢组学的生物标志物可用于支持牛奶营养质量控制、牛奶安全保证、哺乳动物临床诊断和乳制品的工艺特性。为了全面了解代谢组在牛奶研究中的应用，表4根据代谢物的类别对已报道的研究进行了总结。生物标记物的可变性是不同研究中的一个重要问题，这使得为特定的研究选择稳健的生物标记物具有挑战性。根据Dragsted等人总结的生物标志物验证标准，评价候选生物标志物应考虑回顾、可信、可靠性、稳定性、分析性能和重现性。当不可控因素的影响比已调查的变异更显著时，生物标记物可能没有用处。为了严格评估与上述因素相关的候选牛奶生物标记物的有效性，建议选择至少满足两个标准的候选生物标记物。例如，胆碱和柠檬酸可以作为区分牛奶与荷斯坦奶牛和泽西奶牛的生物标志物，因为在Sundekilde等人和Yang等人的研究中，他们都报告了相同的变化。因此，筛选出的强有力的生物标志物及相应的选择标准也列于表4中。选择具有两个标准的标记物是在本综述中呈现数据的主观选择，但是，应当确定适合于将要进行的调查目的的标准。虽然牛奶代谢组学研究已经有了许多成熟的分析方法和应用报道，但目前还需要更多的研究，才能完全解决与牛奶相关的问题。首先，到目前为止，大多数研究都集中在牛奶的脂肪酸或脂质分布上。水溶性代谢物在新陈代谢中起着重要的作用，这值得重视。其次，需要更好的实验设计，因为许多方面的变异都可以通过适当的抽样和统计分析在技术上加以控制。可控变量包括奶牛品种、泌乳阶段、季节和储存。如果它们的影响无法消除，也应该考虑到其他因素，比如个体之间的差异。最后，应进一步建立基于代谢组学的候选生物标志物筛选方法及其在牛奶掺假检测中的应用。随着检测技术的提高，代谢组学方法将在牛奶相关研究中发挥越来越重要的作用。
Criteria1: P -可信性，R1-可靠性，S-稳定性，AP分析性能，R2-重复性原文链接： https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S092422442030724X
