原名：Sub-nanoliter metabolomics via mass spectrometry to characterize volume-limited samples译名：通过质谱法进行亚纳升以下的代谢组学研究以表征体积受限的样品通讯作者：Facundo M. Fernández通讯作者单位：美国佐治亚理工学院佩蒂特生物工程与生物科学研究所
1. TENGi质谱
TENGi nanoESI源如图1a所示，这里使用的TENG类型是滑动的独立式TENG（图1b），一对摩擦电层和一对铜膜电极构成发生器，摩擦电层由尼龙层（12×12 cm）和氟化乙烯丙烯（FEP）固定层（24×12 cm）制成，TENG的输出断分别连接到离子源和接地。我们将样品溶液加载到纳米喷雾发射器中，通过将10mm宽的铜箔带缠绕在发射极周围，使用铜电极来诱导喷雾而不直接与样品溶液接触。TENGi nanoESI设置的照片如图1c所示，即设计了一个定制的墨盒来保护纳米ESI发射器，并固定发射器尖端和MS入口之间的距离。
图1 TENGi nanoESI图示、机理和特点
a，TENGi nanoESI系统的示意图；b，本研究中使用的SF TENG设备示意图；c，在TENGi实验中用于固定nanoESI发射器的定制墨盒的照片；d，等效电路；e TENGi中的电荷生成机制。M和S分别代表代谢物和溶剂分子；F由TENGi nanoESI产生的1μL MeOH:H2O混合液（1:9 v/v）的总离子计时图（TIC）以及分析前后发射极中所含溶液的照片；g，传统DC ESI / nanoESI和TENGi中样品利用率的图示。
该系统表现了相当于三电容电路的形式（图 1d）：第一个电容器（C1）包括两个TENG电极/空气/电极区域，它们通过尼龙和FEP电极的相对机械运动充电，第二电容器（C2）由nanoESI发射极内部的铜电极/玻璃/样品溶液形成，第三（C3）包括样品溶液/空气/质谱仪入口，C3可以看作是漏电电容器，因为当累积的电荷数大于样品溶液保持电荷的能力时，会散发出小滴并开始电离。TENG的充电机制如图2所示，其过程发生在图1e所示的发射器尖端，作为一种类型的非接触式的ESI，电荷主要是由静电场诱导的分子极化、电离和电荷分离而产生的。在进行TENG之前，溶液中的电解质要均匀分布以满足电荷平衡；一旦激活了TENG，就会在C2和C3中产生静电场，产生电喷雾并电离化。由于使用TENG供电的nanoESI是脉冲电离方法，每个脉冲仅消耗几皮升样品溶液，因此0.8 µL样品足以产生数千个脉冲信号。图1f是通过将0.8 µL MeOH:H2O混合液（1:9v/v）装入纳米喷雾发射器而获得TENGi-正离子模式的总离子计时图，在25分钟（0.8 Hz）中产生了1200多个正信号脉冲，实验结束后，nanoESI发射器中仍有约0.6 µL的未消耗样品（图1f右下图）。更多的脉冲信号意味着更高级的MS信息（例如，MS2，取决于数据的采集）从而很容易地获得许多小样品量的代谢产物；如果样品库存极少，则此方法可用于在以后进行样品代谢物注释或其他MS实验的样品保存。TENGi另一个优点是它的脉冲特性与Orbitrap和飞行时间等脉冲质量分析器的间歇特性更匹配。如图1g所示，常规的DC ESI/nanoESI连续提供样品，但只有一小部分被质谱分析器利用，当分析器忙于扫描离子时，会浪费一大部分样品。在TENGi的情况下通过同步电离和质量分析仪周期，我们可以更充分地利用每个喷雾事件来生成MS信息，从而在分析过程中最大程度地减少样品浪费。TENGi的另一个特点是高MS灵敏度，这与产生的高电压和有限电荷有关。图2a、b显示了这项工作中TENG的电学性质，测得最大电荷输出为1.37 µC（图2a）。使用外部负载电阻测得的TENG电压为±5 kV（图2b、c），由于纳米电喷雾本身更高的电阻，实际输出电压可能会达到更高的值。常规DC nanoESI无法获得这样的电压，因为它们会导致放电并会对ESI发射极乃至质谱仪电子设备造成不可逆转的损害。
图2 TENG装置和TENGi nanoESI表征a，在这项工作中TENG设备的测定短路电荷（Qsc），每个周期产生的电荷为1.37 µC；b，测量的TENG输出电压（Voc）；c，用于TENG输出电压测量的等效电路，使用100GΩ的外部负载电阻使电压达到电压表的测量范围，蓝色正方形表示TENG设备的等效电路；d-f，具有TENGi和常规DC nanoESI的四种典型代谢物标准品（腺嘌呤，赖氨酸，葡萄糖和lysoPC）的行为；g-i，TENGi和DC nanoESI检测健康志愿者呼出气凝结物（EBC）中的乳酸（[M-H]- m/z = 89）：g，单次扫描常规DC nanoESI质谱图，h，单次扫描TENGi nanoESI质谱图；i，从104次nanoESI扫描产生的平均质谱图。TENG达到的较高瞬态电压与优异的电离性能有关，我们将四种典型的代谢物标准品用于测试TENGi与DC nanoESI（腺嘌呤，赖氨酸，葡萄糖和lysoPC）的性能，发现就电离加合物的形成而言，两种方法的行为相似，但使用TENGi时离子丰度更高（图 2d，e）。TENGi还能够检测较低的丰度信号，例如[葡萄糖+K]+，[18：1 lysoPC + K] +和[葡萄糖+ NH4]+，而DC nanoESI则不能达到这么低的检测限（图2f）。由于TENG所传输的电荷数是有限的（图2a）而所产生的高压是瞬态的（图2b），因此我们没有观察到明显的源内碎片化。TENGi在电离方面的出色表现还可以从健康志愿者负离子模式的EBC中检测乳酸中看出，图2g–i显显示了乳酸单次扫描光谱中观察到的灵敏度改善的对比。在EBC恶化期间我们检测到乳酸，用TENGi（图2h）观察到的离子丰度比常规DC nanoESI（图2g）观察到的高5倍，信噪比增益大于20倍，DC nanoESI需要平均进行100次以上的扫描才能获得比单次扫描TENGi信噪比为三分之一的质谱信号（图 2i）。为了比较TENGi和常规DC nanoESI在复杂生物样品分析中的覆盖率，我们使用了这两种技术来分析稀释后25 μg mL-1的肝脂质提取物（图3）。在正离子和负离子质谱中（图3a，e），TENGi产生的离子丰度比常规DC nanoESI高得多，DC nanoESI和TENGi都能检测到最多的化合物种类，但是较低丰度的化合物例如m/z 800.616（图3b）和m/z 919.555（图3f）无法用DC nanoESI检测到，但TENGi依然能检测到这些物质并产生足够的离子电流，从而可进行MS/MS分析（图3c，g）。在阳离子模式下，TENGi比DC nanoESI产生了300多个特征（图3d）。在负离子模式下，TENGi检测到的特征数量几乎是DC nanoESI的两倍（图3h）。
图3 通过常规DC nanoESI和TENGi MS分析的肝脂质提取物（25μg mL -1）a–d，正离子模式MS对比：a，完整的MS，b，由TENGi检测到的m/z 800.616的局部放大图，但未通过DC nanoESI检测到，c，TENGi MS / MS鉴定的m/z 800.616的种类；d，在700–1000 m/z范围内在正离子模式下检测到的特征数量； e–h负离子模式MS对比：e，完整MS；f，由TENGi检测到的m/z919.555局部放大图，但未通过DC nanoESI检测到。g，用m/z 919.555对物种进行MS/MS鉴定；h，负离子模式下在700–1000 m/z范围内检测到的特征数量。
2. CF（囊性纤维化）患者的亚纳升代谢组学
CF始于婴儿期，在CF婴儿或儿童的EBC监测代谢表型变化已被确定为一种监测疾病进展和实施早期干预有前景的方法。CFRD（CF相关糖尿病）是CF中最常见的合并症之一且有20%的青少年和50%的成年人患有糖尿病。与没有糖尿病并发症的患者相比，患有糖尿病CF患者的发病率和死亡率明显更高，而他们的死亡是由于肺功能急速下降最终引发呼吸衰竭，而非心血管并发症，然而尚不清楚为什么代谢异常（例如葡萄糖代谢异常），会加剧肺功能丧失，缺乏了解的部分原因是受影响的组织难获取以及代表性动物模型的可获得性有限。基于上述原因，研究CF患者糖代谢异常逐渐加重并最终发生CFRD时EBC代谢组的变化，有望成为了解CFRD病理生理学的一种手段。由于现在科研人员认为CFRD起源于儿童早期，因此从幼儿收集的EBC上的TENGi代谢组学分析可能有助于研究与CFRD相关的早期生化过程。EBC作为一种生物流体因其可无创收集的特点而备受关注。然而，因被呼出的水蒸气高度稀释，故通常需要至少1mL的样品浓缩20倍才能得到有信息的LC-MS数据。青少年和成年人通常需要通过试管收集设备进行10分钟以上的呼吸，才能获得1mL 的EBC，受试者允许稍作休息但是对于幼儿和婴儿来说，这种收集极具挑战性。我们的目的是探讨评估婴幼儿气道代谢状况的可行性，因为随着CFRD的发展葡萄糖代谢会恶化。通过口服糖耐量试验检测到糖尿病前期/糖耐量受损(CFIGT)，我们确定了早期糖稳态异常的CF患者。我们收集这些CF患者(禁食)前和摄入葡萄糖饮料后2小时的EBC，为了简单起见，将这两组EBC样本命名为Pre和Post，每组十个EBC样本。EBC TENGi代谢组学的整体工作流程如图4a所示，该工作流程每个样品仅使用50 µL EBC，相当于收集时间不到1分钟。
图4 TENGi MS EBC代谢组学的实验和数据处理工作流程a，EBC样品收集和TENGi MS分析的图解；b，TENGi MS运行顺序，包括方法空白，质量控制（QC）和EBC重复样品。交错方式运行Pre和Post样品并按其总体顺序随机分配，每个样品进行三个重复测试，根据提取的离子计时图脉冲区域，剔除异常值；c， TENGi MS数据处理协议。a从数据集中删除了丰度低于2000的光谱特征；b采用空白过滤去除归一化丰度低于空白丰度3倍的特征；c必须在至少80%的EBC样本中检测到质谱特征，否则将其删除；d筛选出质量分数为80%或未检测到的QC中的光谱特征，并将缺失值超过20%的样品视为异常值并删除；e缺失值替换为原始数据中最小正值的一半；f中位数相对SD（RSD QC）> 30%的QC特征已删除。四个过滤过程的顺序可以互换。可重复性在代谢组学中至关重要，因为它对微小扰动敏感，为了确保TENGi光谱指纹图谱的最大重现性，我们采取了几个重要步骤。这些步骤包括：（1）使用商用nanoESI发射器以确保可重现的喷嘴直径；（2）定制设计的滤芯以支撑喷头（图 1c），从而最大程度地提高了喷涂位置的可重复性；（3）机械马达，以标准化腾力致动频率和位移距离；（4）用稳定同位素标记的内标（IS）加标样品，以监测每个脉冲的质量。我们将质量控制（QC）样品与EBC样品相互分散，以监测仪器的技术差异（图4b），严格的实施了多步骤数据处理协议（图 4c），比如去除低丰度信号，IS归一化，空白信号过滤，缺失值过滤和插补等，以确保最终数据集的质量和可靠性代谢组学结果。13C酪氨酸用作IS，并在所有TENGi实验中都监测了其提取的离子计时图区域，以确保获得最高质量的数据并识别任何异常值，在20%预期中值RSD之外的脉冲积分区域被丢弃。对于给定实验运行中检测到的每个光谱特征，我们计算了QC样品中所有峰丰度的RSD（RSD QC），此步骤是针对相同的nanoESI发射器以及跨三个不同的发射器进行的。如图5所示，我们使用相同nanoESI发射器运行和使用不同发射器运行的RSDQC值分别为12.8%和17.2%，这些值是美国食品和药品管理局针对生物标志物研究所指定的可接受水平。
使用相同的nanoESI发射器（a，b）和三个不同的nanoESI发射器（c，d）之间的TENGi MS重现性。a，c为IS提取的离子计时图，在每个单独的脉冲（7、8、9等）上显示的标签代表IS、13 C酪氨酸的积分面积，不同的颜色代表不同的时间区域。对应的TENGi脉冲平均质谱图分别显示在区域A，B，C和1，2，3。这些颜色与a和c中所示区域的颜色相匹配。b和d所示的发射器内和发射器间RSDQC值的中值分别为12.8%和17.2%。在MS数据收集和处理之后，我们对数据集进行多变量分析以研究葡萄糖诱导的气道代谢谱变化。比较Pre和Post组的局部最小二乘判别分析（PLS-DA）得分图，我们从图6a中可以看出两组的区分情况良好。为了关注引起这两组差异的最重要的特征化合物，根据火山图以及PLS-DA VIP值，我们将VIP评分> 1.8（图6b）的化合物选进作为判别标准的差异性特征化合物列表。五个代谢特征是区分前组和后组的最重要特征。图6c-g显示了这五种重要代谢物的箱形图，表明葡萄糖激发试验2 h后EBC的显著变化，而我们发现五种代谢物均增加。
图6 CF IGT患者口服前后糖耐量测试TENGi代谢组比较结果
a，使用所有特性的PLS-DA得分图；b，PLS-DA VIP评分图，垂直虚线表示VIP > 1.8临界值；基于该临界值选择了五个代谢特征。c-g，五个特征的IS归一化MS峰丰度的箱形图。对Pre组，测试了n = 10个独立样本而在后组测定了n = 9个独立生物样本。使用双尾学生t检验评估两组之间的差异（***p <0.001，*p <0.05，详细p值分别是：0.00086、0.014、0.019、0.022、0.026），这些是根据G-log转换并通过MetaboAnalyst自动缩放后的最终数据集计算得出的。
这项使用TENGi MS和亚纳升量的EBC进行的概念验证研究成功地证明了该技术用于气道代谢表型的潜在能力。在代谢挑战后的几个小时内，我们从同一受试者收集的最小样本量能够检测代谢组学变化，这为传统方法通常不适用的研究开辟了新的可能性。基于MSCs的治疗在治疗一些骨科、自身免疫性疾病、心血管疾病和神经退行性疾病方面已显示出潜力，这些细胞具有与干细胞相似的特征并可以分化为多种不同的细胞类型。干细胞代谢组学研究可以深入了解它们的生化水平或分泌功能、更好地控制放大过程、揭示供体来源的差异，并提供其功效信息。另外当将MSC培养条件移植到炎热环境中时，它们的免疫调节能力会显着受影响，在体外，用炎症分子如IFN-γ预处理MSCs已被证明可以提高其降低免疫细胞(t细胞)增殖的能力。因此，了解炎症条件下的MSC反应对于开发和改善基于MSC的疗法至关重要。由于MSC通常来自患者供体，因此它们的供应受到限制，并且要扩展到足够数量的代谢组学测试费用很高。这是许多细胞类型的常见问题，例如来自骨髓的造血干细胞或肿瘤来源的基质细胞很难为代谢组学收集足够的数量，导致对稀有细胞代谢组学方法的需求日益增长。Li等人开发出了一种有希望的用于小细胞数非靶向代谢组学的同位素标记纳米LC-MS方法，Morrison等开发了一种靶向代谢组学方法，以筛选造血干细胞和限制性造血祖细胞中的50种代谢物。为了测试TENGi对小细胞数量代谢组学的能力，我们通过TENGi MS研究了在正常和IFN-γ刺激的炎性条件下培养的MSC。分析每个样品仅使用80000个细胞。实验流程如图7a所示，数据处理采用类似于EBC代谢组学的工作流程（图 4c）。
图7 IFN-γ刺激的MSC的TENGi亚纳升代谢组研究。a，TENGi MS工作流程；b，IFN-γ刺激的（S）与未刺激的（U）MSC的火山图；c，PLS-DA VIP得分图，其中前20个特征按其PLS-DA VIP得分排名；d，利用火山图标准和PLS-DA VIP评分> 1.8选择14个重要特征，对IFN-γ刺激的MSCs与未刺激的MSCs进行主成分分析的评分图；e，相应的主成分分析评分loading图可区分识别受刺激的MSC与未受刺激的MSC的特征。
为了专注于将受刺激与未受刺激的细胞分开的最重要特征，两个火山绘图标准（图7b）且PLS -DA VIP得分> 1.8（图 7c）被选为最终特征集。我们使用灵敏、高分辨率的MS和MS/MS成功地对这些标准的14个特征化合物进行了注释（表 1）。我们使用IM-MS/MS标注了这一特征（＃3），因为在标准MS / MS实验中我们观察到前体离子共选择，这14个特征的PCA得分图显示了非常清晰的聚类（图 7d），并且对主成分1和2的载荷有明显贡献（图7e）。
表1 区分受激和未受激MSC时使用的14个最重要特征的注释
TENGi MS对受刺激的MSC的代谢组学研究表明，在炎症条件下，得分最高的11种代谢物富集，而3种特征化合物（＃2、8和14）的丰度降低（图7e）。捕捉不同条件下培养的MSCs代谢差异对于有效识别治疗性细胞质量生物标志物至关重要，此外也可显著减少所需细胞或样本数量的代谢组学探针的开发，我们可以使其融入当前的细胞制造过程，并帮助保存大多数生产出来的细胞供患者使用。
表1中FC值的检查表明，ATP分解的产物次黄嘌呤在IFN-γ刺激下急剧下降。据推测，与炎症过程相关的氧化应激会导致线粒体持续受损并导致ATP耗竭。特征＃4的牛磺酸的丰度显着增加，这种代谢产物被认为发挥重要抗氧化的并提供抵抗活性氧，因此其丰度增加可能与IFN-γ刺激后MSC中触发的保护机制有关。Vunjak-Novakovic等人先前已经报道了IFN-γMSC刺激后牛磺酸浓度的类似趋势，他们使用GC-MS，每个样品200万个细胞，是我们在此使用的数量的20倍。
图8a中的热图显示了所研究的每个MSC样本的前14个特征的分布。通路分析表明，色氨酸的分解代谢通过三种不同的途径发生变化（图 8b），主要为1 -kynurenine，5-hydroxy-1-tryptophan（5-HTP）和3-methyldioxyindole（3-MDI）改变。如图8c所示，色氨酸与其他六个物种呈负相关，其中五个是图8d中所示的色氨酸分解代谢产物：5-HTP（m/z 220.1077，m/z 243.0745），L-犬尿氨酸（m/z 209.0927, m/z247.0476）和3-MDI（m/z 146.0598），图6d显示这五个特征的绝对相关系数均> 0.8。总的来说，这些结果进一步证实了IFN-γ刺激通过三种不同途径影响了MSC色氨酸的代谢。
图8 IFN-γ刺激通过三种分解代谢途径影响MSC中的色氨酸代谢a，最重要的14个特征的热图；b，通路分析结果显示三种分解代谢途径受到影响，箱形图显示了这些色氨酸相关代谢物的变化；c-d，与m/z 227.0793（色氨酸）密切相关的特征有6个，其中5个来自b通路分析显示的色氨酸分解代谢产物。
当MSC受IFN-γ攻击时，MSC通过犬尿氨酸代谢改变了色氨酸的分解代谢，先前已在MSC中观察到此现象。暴露于IFN-γ的MSC也可增强酶吲哚-2,3-双加氧酶的表达，这是MSC介导的T细胞增殖抑制作用的关键调节剂，可耗尽色氨酸池。TENGi MS确实检测到通过犬尿氨酸途径的色氨酸分解代谢的变化，犬尿氨酸的功能系数（特征＃6，m/z 209.0927）为15.6（表 1和图 6b）;同时，还检测到色氨酸的含量显着降低（表 1，特征＃8，FC＝0.0066，图 6b）。Vunjak-Novakovic等人观察到IFN-γ刺激MSC中犬尿氨酸含量增加，但未检测到色氨酸的减少。5-HTP和3-MDI途径在IFN-γ刺激后也显示出显着变化，以前尚未报道与MSC的炎症反应相关。5-HTP是5-羟色胺的直接前体，在炎症条件下可抑制多种免疫细胞类型的细胞凋亡;关于3-MDI，文献中已有关于在大鼠尿液、血清和人的呼吸中检测到的报道，但炎症刺激后其在MSC中的功能尚不清楚。
TENGi亚纳升代谢组学只有80000个细胞且检测时间少于1分钟，在原理验证研究中对小细胞数量代谢组学表现出良好的性能。TENGi可能不需要其他几轮培养就可以受益于其他稀有细胞类型的代谢组学研究，它不仅适用于像MSCs这样放宽样本量要求可以促进生物研究和生物材料制造的情况，而且还非常适用于像EBC这样难以收集大量样本的情况。
4．电压极性切换实验
由于TENG交替产生正脉冲和负脉冲，因此该技术与现代质谱仪的快速极性切换功能相结合，可以在一个实验中实现正负MS信息的检测。该实验可覆盖碱性代谢物和酸性代谢物，而无需其他实验和样品消耗，从而进一步增加了每个实验或每个样品的信息密度。肝脂质提取物的概念验证实验如图9所示,正负离子谱图均在同一运行程序中获得，仅需亚微升样品上样量和亚纳升样品消耗量。
图9 在亚纳升样品消耗的情况下，采用极性开关技术在同一实验中同时获得正负信号。
测试的样品是50μg mL -1肝脂质提取物。a，结合极性切换的TENGi的TIC，蓝色是“-”符号，红色即“+”符号；b，装有0.8 μL样品的发射器详细信息。黄色箭头指示样品溶液在发射器中的位置；c，负脉冲的质谱图；d，正脉冲的质谱图。
与以有限的分析物为目标的假设驱动研究不同，非靶向代谢组学致力于在一个实验中监测数百到数千种分子种类,非靶向代谢组学可以被认为是一种假设生成过程，对于发现以前未知的生物标志物和生化途径具有广阔的前景。
经典的代谢组学工具（例如LC-MS和核磁共振谱）需要相对较大的样品量，导致许多样品类型的不适用。TENGi MS是一种脉冲技术，通过消耗亚纳升以下的样品从而充分利用了每次电喷雾过程。TENGi MS代谢组学所需的储备样品量至少比常规GC/LC-MS代谢组学所需的样本量低10-20倍，其较低的样品量使其成为针对靶向或非靶向模式的稀有样本代谢组学研究的最佳选择。
喷雾脉冲与质谱仪扫描的同步以及将TENGi与快速极性切换的耦合可用于提高样品利用率，并使从有限数量样品中获得的信息最大化。TENGi的高灵敏度源于TENG本身的高压输出，与传统的nanoESI技术相比，能够检测具有显着信噪比增益的代谢物。对EBC和培养的MSC样品进行的小体积TENGi代谢组学先导研究说明了与高分辨率精确质谱仪结合使用时该方法的可能性,其他数量有限的样品类型，例如外泌体、组织来源的细胞、穿刺活检、眼泪和汗液，也可以从此处介绍的纳升以下代谢组学策略中受益。
总体而言，TENGi MS代谢组学对极少量样品分析已显示出广阔前景。然而，当前配置的一个明显缺点是需要手动上样，这个问题可以在未来通过机器人自动化解决。还需要注意的是，TENGi MS是一种DI代谢组学方法，与其他DI方法类似，它缺乏同质量分辨率。将TENGi与IM-MS耦合将是一种可进一步扩大覆盖范围的方法，并可以应用于更广泛的稀有样品代谢组学研究。
