科研| APPL ENVIRON MICROB：形成蓝藻水华的铜绿微囊藻和水生微生物之间的反馈调节关系
编译：Peragh，编辑：谢衣、江舜尧。
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全世界蓝藻水华发生的频率和强度都在增加，所以需要对有毒蓝藻和水生微生物之间的相互作用关系进行严格地评估以了解蓝藻水华对微生物的驱动因素和调节因素。在本研究中，当体系中溶解性无机氮磷(DIP)浓度与太湖中浓度相近时，我们应用16S/18SrRNA基因测序和代谢组学分析方法探究了共培养体系中了微生物的群落结构和代谢物组成对铜绿微囊藻暴露的响应。当磷源不足时，铜绿微囊藻细胞分泌的碱性磷酸酶能够对濒临死亡和腐烂的微生物产生的DIP进行利用。在此过程中，铜绿微囊藻积累了能量代谢途径中的几个中间产物从而为持续其高生长速度提供能量，并增加了胞内糖分以增强其竞争能力和抵御微生物攻击的能力。它还会产生包括微囊藻毒素在内的多种有毒物质，通过水生微生物的能量代谢途径抑制代谢物的形成，从而对细菌和真核微生物的丰度和多样性产生负面影响。总体而言，与单一培养体系相比，共培体系养促进了铜绿微囊藻的生长，而抑制了体系中部分共生微生物的生长，其中真核微生物的多样性和丰度受到的负面影响比原核微生物更大。这些发现为阐明铜绿微囊藻如何潜在地调节其与其他微生物的联系及其在水生生态系统中的优势地位提供了有价值的信息。
论文ID
原名:Feedback Regulation between Aquatic Microorganisms and the Bloom-Forming Cyanobacterium Microcystis aeruginosa
译名：形成蓝藻水华的铜绿微囊藻和水生微生物之间的反馈调节关系
期刊：Applied and Environmental Microbiology
IF：3.961
发表时间：2019.08
通讯作者：钱海丰
通讯作者单位：浙江工业大学环境学院
实验设计
本实验采用共培养设计方案研究无菌铜绿微囊藻与水生微生物之间的相互作用（图1A）。无菌透析纤维素膜管能够分离铜绿微囊藻和湖水微生物群落，起到防止铜绿微囊藻和自然产生的微生物种群之间的细胞接触并且允许小分子化合物通过透析膜渗出的作用。在培养之前，将水生微生物和铜绿微囊藻进行离心并用超纯水多次清洗，然后在改性BG-11培养基（NaNO3，10mg/L；K2HPO4，1mg/L）中培养1d，使其适应本实验共培养体系中的实验条件。通过三组实验观察铜绿微囊藻及其相关水生微生物的生长情况。（i）对于共培养组，将装有180 ml铜绿微囊藻培养物（Treat Ma）的无菌透析袋浸入900 ml水生微生物培养基（Treat aM）中，并在2000 ml灭菌玻璃烧杯中共培养。（ii）对照组1，将装有180毫升铜绿微囊藻培养物的透析袋（铜绿微囊藻对照组，Con-Ma）浸入900毫升含铜绿微囊藻的培养基中。因为共培养组在透析袋外加入900毫升水生微生物，所以在单培养组也加入900毫升铜绿微囊藻培养液浸泡透析袋，以保持培养条件与共培养组一致。仅从180毫升透析袋中收集分析用样品。（i i i）对于对照组2（类似于对照组1），将装有180 ml含水生微生物培养基的透析袋浸入900 ml水生微生物培养物中（即水生微生物对照组[Con AM]）。
实验结果
1铜绿微囊藻与微生物生长状态
从图1B可以看出，在共培养3天后，实验组680nm处的光密度（OD680）和铜绿微囊藻细胞数量显著高于对照组。然而，处理AM组（即用水生微生物处理）的OD680和叶绿素a（Chl-a）水平显著低于对照AM组（图1C）。此外在共培养过程中，处理组的溶解氧（DO）和pH值显著低于对照组（图2）。由于密集的微囊藻种群可以通过夜间呼吸和死亡细胞的微生物分解会消耗氧气，所以导致水中供氧不足，无法支持需氧微生物和高等生物的需氧量。同时二氧化碳浓度的增加将无机碳平衡从碳酸盐转移到碳酸氢盐，从而降低pH值，进而抑制一些微生物种群的生长。此外对死亡细胞的分解也会导致实验组的耗氧量增加（图2）。本实验还研究了各组的电导率(EC)随溶解材料的类型和数量的变化，与对照组相比，共培养3天和6天后，对照组的电导率明显上升。值得注意的是，这些水质参数(图2)，特别是pH值，在单一培养和共培养系统之间存在显著差异，这表明水中的这些理化变化直接或间接地受到铜绿微囊藻代谢以及相关微生物群落的影响。
2培养基中释放的N、P和MCs的变化
氮和磷的有效性是控制初级生产力和氰化赤潮动态的关键因素。在本研究中，共培养1天和2天时，实验组中的总磷(TP)和DIP浓度低于对照组中的总磷和DIP浓度，而在共培养3-8天后，实验组中的总磷和DIP浓度高于对照组中的总磷和DIP浓度(图3A)。当总磷浓度过低不能满足藻类生长需要时，许多藻类可以合成碱性磷酸酶(AKP)将DOP水解成DIP。与之前的研究一致，在共培养2和4天后，实验组的AKP显著增加，然而AKP随着DIP的增加而减少(图3C)。这些结果表明，铜绿微囊藻对生物体代谢产物中DOP的清除能力很强。随着铜绿微囊藻的生长，实验组中的硝酸盐氮(NO3-N)浓度也远高于对照组(图3B)。这是由于铜绿微囊藻在共培养系统中对一些伴生物种的生长产生了负面影响，导致死亡细胞释放氮源，同时水生微生物的减少也降低了氮源的消耗。这为铜绿微囊藻的生长提供了一个现成的氮源，这可能在一定程度上解释了为什么铜绿微囊藻在实验组条件下的生长优于对照组。铜绿微囊藻在共培养条件下生长更好的原因可能有多种，包括互利代谢物(如维生素)的交换、CO2的补充以及营养物质和必需金属的交换。实验组中铜绿微囊藻比对照组中生长更快，而且能够产生大量的MCs释放到培养基中。共培养3天后，实验组的MCs含量显著高于对照组(图3D)。且大量研究表明MCs对某些微生物是有毒的，我们的数据也表明MCs会导致水生微环境中浮游植物总量减少(见图7a)。
3共培养条件下水生微生物群落结构和多样性的变化
微生物群落多样性是基于OTUs水平进行计算的。Shannon和Simpson指数反映了群落的多样性和均匀性，ACE和Chao1指数反映了物种的丰富度。在第4天和第8天的时候，与对照组相比实验组中的ACE和Chao1指数都呈下降趋势，在第八天的时候Shannon和Simpson多样性指数也稍微下降，表明细菌群落的丰度和多样性都下降。表1显示了样本中观察到的物种数量，表中对照组各项数据的数值较高也证明了其物种丰度和多样性高于实验组。占主导地位的蓝藻生物量的变化会影响微生物种群的组成和功能，而竞争性排斥往往会导致其他物种丰度的减少，所以更容易在藻华期间“放牧”初级生产者。主坐标分析(PCoA)表明，PC1(第一主成分)和PC2(第二主成分)解释83.89%物种组成的变化(图4）。共培养的模式可能构成PC1的主要部分，因为它导致实验组和对照组的样品在培养4和8天后分离，而营养状况、pH、捕食等环境因素可能构成PC2且在培养的一定时间内(4 ~ 8天)会影响OTUs的组成。如图4B所示，前两个冗余分析(RDA)轴的特征值解释了总变化的67.42%。RDA得分显示环境变量与这四个群体之间有很强的相关性。对照组中第四天和第八天的样品与EC、DO、pH、NO3-N呈正相关。实验组中第四天和第八天的样品聚在一起并且与MCs和DIP的相关性最高。
细菌群落分析表明，实验组和对照组在第4天和第8天时，纲水平上微宇宙中的微生物群落均以蓝藻、α蛋白细菌、β蛋白细菌和鞘氨醇细菌为主(图4C)，而其他类的微生物所占比例均不超过1%。实验组和对照组中蓝藻(>50%)均是优势类群，在第4天和8天时蓝藻丰度排名前4位的是伪鱼腥藻、平裂藻、湖生蓝丝藻和Arronema gygaxiana UTCC393(图4D)。有趣地是，除伪鱼腥藻外，实验组（第8天）的水生微宇宙中蓝藻的丰度显著低于对照组（第8天）。一些淡水细菌的生长已被报道与蓝藻水华有关，但浮游植物门水平上的物种如变形杆菌，类杆菌和放线菌的丰度基本不变。与铜绿微囊藻共培养后，α蛋白细菌和β蛋白细菌显著增加，鞘氨醇细菌减少，说明某些细菌的丰度受到铜绿微囊藻生物量增加的影响。此外，与铜绿微囊藻共培养扰乱了稀有微生物的组成(相对丰度为>1%)，稀有微生物在共培养8天后相对丰度降低或消失。
4共培养条件下真核微生物群落结构和多样性的变化。
第4天到地8天，对照组中物种多样性和丰度的下降表明真核生物数量随着时间的推移而减少(表2)，实验组中物种多样性和丰富度没有表现出下降的趋势，但与对照组组相比，在第4和8天时，实验组群落的ACE指数和Chao1指数以及Shannon和Simpson多样性指数都有下降的趋势。这些发现表明共培养降低了真核物种的多样性和丰富度。PCoA结果显示，PC1和PC2解释了92.03%的β多样性(图5A)。对照组（4天）和实验组（4天）的坐标被PC1分离，对照组（8天）和实验组（8天）受到PC2的影响更严重。共培养4d的变化可能受铜绿微囊藻的影响，pH、溶解氧等理化水质参数的变化，也可能与共培养8d有关。在真核生物群落中鉴定出了许多不同的物种，包括一些假菌界物种，如纤毛虫和褐藻门；后生动物，如轮虫；病原菌如链霉菌；真菌如隐孢子门、子囊菌门和双核菌亚界(图5B)。真核生物之间在捕食、竞争关系和寄生等方面存在相互关系。在对照组中，轮虫是最丰富的真核分类群，第4天和第8天分别占对照组真核序列的29.88%和43.81%。轮虫通常是非常活跃的食草动物，会影响浮游植物的生物量和丰富度。与对照组相比，实验组在共培养4天和8天后轮虫的相对丰度分别下降到8.00和23.45，纤毛虫成为实验组中最丰富的真核生物。作为消费者，轮虫和纤毛虫在捕食和营养竞争方面是相互联系的。我们的研究表明，有毒水华对这些活跃的食草动物的组成有更大的影响，所以这也会改变他们的饮食对象 。在实验组中其他真核生物，如隐孢子门、链孢菌门、子囊菌门和脊索动物门在共培养后减少。此外与对照组相比，实验组中稀有微生物更接近坐标轴，表明稀有微生物减少或完全消失(图5C)。而稀有微生物和常见类群之间的协同作用也可能在维持真核生物群落的稳定及其生态功能方面发挥核心作用。
5在共培养和单培养体系中铜绿微囊藻和水生微宇宙中的代谢反应。
为了阐明铜绿微囊藻对微宇宙中群落影响的潜在机制，我们检测了铜绿微囊藻和微宇宙中代谢产物的变化，共鉴定出239种代谢物，PCoA和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)的得分图表明，实验组和对照组中的微宇宙体系和铜绿微囊藻沿PC1线微明显的分离(图6A)。在多变量统计分析中，通过计算组间变量重要性(VIP)来筛选和确定差异变量。VIP是PLS-DA的加权平方和，指示变量对整个模型的重要性。VIP为>1的变量被认为是负责分离的变量，在本研究中被定义为区分代谢物。在单变量统计分析中，使用P值来评估不同变量的统计显著性。我们结合这两个标准筛选出VIP为>1，P值为<0.05的变量作为差异变量。观察到铜绿微囊藻(53个下调和31个上调)、来自微宇宙的水生微生物(39个下调和18个上调的代谢物发生了显著的变化。)和培养基样品(53个下调和10个上调)。
6在共培养和单培养体系中铜绿微囊藻和水生微生态系统的代谢特征和途径变化
与对照组相比，实验组中铜绿微囊藻的(图6B)戊糖磷酸代谢(PP)途径和糖酵解中间产物，如葡萄糖-6-磷酸(G6P)、果糖-6-磷酸(F6P)和核酮糖-5-磷酸(Ru5P)显著增加。G6P和F6P通过与卡尔文循环的生化反应相互联系，以糖原生物合成来消耗能量。它们的积累对铜绿微囊藻的生长起到了积极的作用，说明共培养体系提高了铜绿微囊藻的固碳能力。实验组中琥珀酸，三羧酸(TCA)循环的中间产物比对照组高18.30倍，PP途径、糖酵解和TCA循环中这些增加的中间产物可以为氨基酸合成和其他细胞大分子的转移提供前体。它们也有利于AKP和MC合成和细胞生长所需的还原酶(NADPH和NADH)和能量(ATP)的产生。铜绿微囊藻的AKP合成暗示了细胞对胁迫的反应，特别是DOP的水解，以支持DIP含量较低条件下铜绿微囊藻的生长。较高的代谢水平会加速铜绿微囊藻的生长，这种有机体形成的聚集体在与微生物的竞争中占据主导地位，并产生各种有毒物质，抑制其他微生物的生长。这一结论在图1B和3D如图所示，其表明了共培养体系中铜绿微囊藻的生长速度明显快于单一培养体系，并产生了大量的MCs。总体而言，铜绿微囊藻中这些途径的上调有利于MCs、AKP和能量的产生，从而提高铜绿微囊藻的竞争能力和防御能力。糖参与能量代谢，其作为信号分子或渗透保护剂发挥关键作用。在共培养过程中，处理组中可溶溶质(如塔格糖、1，5-脱水葡萄糖醇、蔗糖或同种异体)的显著增加降低了细胞内的水势以维持渗透压从而避免脱水，比如在盐胁迫期间。
与对照组相比，实验组铜绿微囊藻中的几种脂肪酸含量呈现下降的趋势，如1-棕榈酸单甘油酯(0.76倍)、硬脂酸(0.63倍)、棕榈酸(0.60倍)和花生四烯酸(0.51倍)。脂肪酸和带有磷脂的固醇是质膜的主要成分。磷脂由极性头基、甘油酯和两条脂肪酰链组成。与磷脂极性头基有关的甘油代谢在共培养条件下显著增加(P≤0.05)。这些发现支持这样的假设，即铜绿微囊藻通过调整其膜成分来维持膜的完整性，而铜绿微囊藻的细胞分裂的增加会改变细胞内的代谢从而重建膜的完整性。
氨基酸作为渗透调节剂在蓝藻的生理过程中起着重要的作用，是合成防御相关代谢物和信号分子的前体。因此对这些代谢作用的了解有助于对蓝藻抵御压力的整体理解。这些氨基酸包括羟胺(0.71倍)、去甲亮氨酸(0.83倍)、N-甲基-D、L-丙氨酸(0.71倍)和丙氨酸(0.72倍)，实验组这些氨基酸的含量均低于对照组。我们推测对照组氨基酸(含N元素)的减少是由于蛋白质合成加速以满足铜绿微囊藻的生长所致。天冬氨酸是铜绿微囊藻合成微囊藻毒素的重要底物，可由微生物通过TCA循环中间体合成。因此实验组中天冬氨酸的增加可能有助于微囊藻毒素的过量生产(图3D)。
在微宇宙中，实验组中几个参与能量代谢途径的中间产物，如糖酵解、TCA循环和糖代谢在共培养后减少(图6C)。这些中间体的减少可以归因于负面环境因素(pH、DO、MC和DIP)导致水生微生物防御能力的降低，这一发现也与共培养后水生微宇宙中Chl-a的减少是一致的。
7种间相互作用的网络关系
在代谢组学水平上，实验组中下列代谢物的含量增加较为明显：D-甘油酸(1.78倍)、 甘油单油酸酯(1.63倍)和二甘油(1.63倍)。此外，共培养基中甘油单油酸酯、D-甘油酸、双甘油和MCs的浓度高于单一培养基中的浓度(表3)，表明这些化合物是由铜绿微囊藻分泌的。甘油单油酸酯无毒且可生物降解，而双甘油可作为碳源生物利用。为了验证其潜在的化感作用，将MCs和D-甘油酸加入到单独的单一培养微宇宙中。叶绿素a含量随微宇宙中MCs的存在而降低，但与甘油酸保持不变(图7)，表明MCs在微宇宙中总浮游植物的减少中起一定作用。我们无法证实MC是否能改变原来培养的微生物群落。然而微宇宙中MCs似乎对附近的一些生物有毒性，会导致浮游植物总量的减少。蓝藻还会与MCs的结合保护蛋白免受氧化应激，从而提高蓝藻的生存能力MCs。在共培养条件下，铜绿微囊藻或水生微生物代谢的各种物质(如葡萄糖-1-磷酸、丙二酸和肉碱)的表达除上调外，下调作用更为明显。且与单一培养相比，这些物质的下调也可能影响共培养水生微生物的生长。
图8显示了共培养后铜绿微囊藻和微生物群落的变化示意图。我们的研究表明，铜绿微囊藻可以分泌AKP，使死亡和腐烂的微生物在磷源不足时产生DOP。同时，铜绿微囊藻产生多种有毒物质，如MCs能够抑制水生微生物在能量代谢途径(如糖酵解、TCA循环、糖代谢等)中积累的一些关键中间产物，从而抑制微生物的生长。在铜绿微囊藻的生长过程中会产生MCs、AKP和能量以增强其竞争能力和防御能力。铜绿微囊藻略微降低了细菌群落的多样性和丰度，但对真核生物的多样性和丰度的影响更为显着。此外，铜绿微囊藻或裂解会释放的一些代谢产物可能对生物群有害，并对藻类竞争对手或捕食者的生长产生负面影响，这可能是使这一光合原核生物群体有机会在广泛的生境中茁壮成长的关键因素。
原文网址：https://doi.org/10.1128/AEM.01362-19