科研 | Science：辐射幸存者的多组学分析鉴定具有辐射防护作用的微生物和代谢物
编译：孙元芳，编辑：Emma、江舜尧。
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电离辐射会引起急性辐射综合征导致造血、胃肠和脑血管的损伤。我们研究了一组在高剂量辐射下生存至正常寿命的小鼠，即“精英幸存者”。我们发现“精英幸存者”在辐射后形成了独特的肠道微生物区系，其在无菌和常规饲养的粪便移植接受鼠中仍能保护其免受辐射诱导的损伤和死亡。毛螺菌科和肠球菌科成员数量的增加与辐射后造血的恢复和胃肠道的修复有关。临床研究显示这些细菌在接受放射治疗时表现出轻微胃肠功能障碍的白血病患者中含量也出现增加。小鼠血浆代谢组学显示精英幸存者粪便中微生物衍生的丙酸和色氨酸代谢物浓度增加。给小鼠服用这些代谢物可以起到长期的辐射保护作用，减轻造血和胃肠道症状以及减少促炎反应。
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实验设计
实验结果
1. “精英幸存者”的独特微生物群
在给予高剂量全身照射(9.2Gy)时，我们意外地观察到暴露的SPF级C57BL/6的小鼠中有5%到15%恢复并长期存活(长达600天)(图1A)。这些老鼠被称为“精英幸存者”。为了确定肠道微生物区系是否是“精英幸存者”所特有的，我们在辐射后第290天时从年龄匹配的对照组小鼠和精英幸存者的粪便细菌DNA中分离的16s核糖体RNA(rRNA)进行了高通量基因测序分析。稀疏分析比较了个体受试者的细菌多样性，结果显示“精英幸存者”与对照组相比拥有独特的细菌群落(图1B)。这些数据通过UniFrac相异距离分析(图1C)进一步量化，并由细菌操作分类单元的热图分析(图1D)进一步证实。
图1 与对照小鼠相比，“精英幸存者”拥有独特的微生物区系
(A)SPF C57BL/6小鼠接受了高剂量的全身辐射，并接受了600天以上的监测。(B和C)显示微生物组成差异的PCA图(B)，由UniFrac距离(C)量化。(D)经排序的细菌操作分类单位(OTU)丰度热图。
2. 微生物区系介导的辐射防护作用
为了更严格地研究微生物区系对辐射防护的贡献，进行了“共居”试验。粪便微生物区系样本通过肮脏的笼子共享实验被动地从“精英幸存者”身上转移(图2A)。因为“精英幸存者”是老年雄性小鼠，所以与年轻雄性受体的传统共居方法可能会导致老年小鼠打架和受伤。使用“精英幸存者”或年龄匹配的对照组小鼠的肮脏的笼子饲养SPF级C57BL/6小鼠。接受者被转移到新鲜肮脏的笼子里接受高剂量的全身照射(8.2~9.2Gy)。被关在以前由精英幸存者(ES-Recip)占据的肮脏笼子里的小鼠近75%存活下来，而那些被关在来自对照组(Ctrl-Recip)的肮脏笼子里的小鼠只有20%存活下来(图2B)。ES-Recip小鼠的临床评分明显比Ctrl-Recip小鼠低(图2C)。
我们分析了脏笼共用后供体和受体粪便中细菌的16S rRNA基因。主成分分析(PCA)和UniFrac相异距离分析表明ES-Recip小鼠(图2，D和E)与Ctrl-Recip小鼠在微生物群组成上存在差异。此外，受体的微生物群组成与其各自供体的微生物群组成相似，表明肮脏的笼子共享策略在从捐赠者到接受者的肠道微生物群交换方面是有效的(图2D)。与对照组相比，“精英幸存者”中丹毒丝菌目的丰度显著降低，而拟杆菌和梭菌的丰度却增加。在ES-Recip小鼠和Ctrl-Recip小鼠中也进行了类似的比较(图2，F和G)。
为了证实微生物区系与辐射防护之间的关系，我们进行了粪便微生物区系移植(FMT)实验，其中无菌(GF)或SPF级C57BL/6小鼠与“精英幸存者”或年龄匹配的对照组的粪便材料重组(图2H)。与对照小鼠相比，来自“精英幸存者”的FMT导致GF和SPF小鼠的存活率提高以及临床评分降低(图2，I和J)。PCA图和UniFrac相异距离显示FMT改变了小鼠微生物群组成(图2，K和L)。线性判别分析(LDA)效应大小分析表明ES-Recip小鼠中有8个分类群富集和5个分类群减少(LDA得分>0.2，图2M)。火山图标记出毛螺菌科是ES-Recip小鼠中最丰富和最具代表性的细菌(图2N)。
我们进行了一项临床研究，探索在小鼠研究中确定的具有辐射防护作用的细菌分类群是否与人类相关。我们收集了接受全身辐射的21个白血病患者的粪便，发现胃肠道副反应的发生率和严重程度与观察到的腹泻程度相关。在30天的观察期内，进行了16S rRNA测序鉴定所有患者(图3A和B)的毛螺菌和肠球菌的丰度。腹泻持续时间较短(<10d)的患者，其淋球菌和肠球菌的数量明显高于腹泻持续时间较长(>10d)的患者。乳酸杆菌属在腹泻病程较短的患者中也有增加的趋势，但未达到统计学意义。毛螺菌的丰度与胃肠道不良反应的发生之间也存在统计学上的显著负相关(图3B)。
图2“精英幸存者”的肠道微生物群保护GF和SPF接受者免受辐射诱导的死亡
(A)肮脏的笼子共用实验图解。(B和C)生存率(B)和临床评分(C)。(D和E)微生物组成的PCA图(D)和UniFrac距离(E)。(F和G)来自供体(F)和受体(G)的实质性改变的细菌群的综合结果被鉴定。(H) FMT实验图解。(I和J)存活率(I)和临床评分(J)。(K和L)PCA图(K)和UniFrac距离(L)。(M) LDA效应大小分析。(N)显示微生物OTUS相对丰度分布的火山图。
3. 小鼠微生物区系的辐照后选择
与拥有不同健康指标的人类不同，我们研究中使用的GF和SPF小鼠应该有相似的基本微生物群组成。为了了解“精英幸存者”如何拥有辐射防护微生物群，需要明确辐射前“精英幸存者”中是否有一个独特的微生物区系占主导地位，还是在辐射后选择性形成了一个独特的微生物区系(图3C)。对57只幼龄SPF级C57BL/6小鼠进行大剂量全身照射(8.2Gy)，分别在照射前(第1天)和照射后第2、7、21、30天采集粪便样本，存活监测超过120天(图3D)。存活超过30天的小鼠被认为是“精英幸存者”。对“精英幸存者”和放射治疗后死亡(死亡者)的粪便样本进行16SrRNA测序。照射前(第1天)，PCA显示精英幸存者和死亡者的细菌组成没有差异。然而到了辐射后第7天，“精英幸存者”出现了一个与随后死亡鼠的细菌群落截然不同的细菌群落(图3E)。与死亡的小鼠相比，毛螺菌和肠球菌在辐射后第7天的“精英幸存者”中显示出更多的数量(图3F)。7天后，“精英幸存者”继续显示出更丰富的毛螺菌和肠球菌，而非幸存者在第21天前逐渐死亡。这些数据表明辐射处理对毛螺菌和肠球菌具有“存活表型”的选择性作用。
在单联合研究中，我们选择了(I)可在属或科水平上鉴定并在ES-Recip组中显示丰富的细菌(图2M)，(Ⅱ)可培养用于体外和体内功能研究的细菌，以及(Ⅲ)可确保重复性的类型菌株。我们测试了由来自于毛螺菌科的23个不同菌株组成的混合菌株介导的辐射防护作用，类似的实验检测了粪肠球菌、脆弱类杆菌和鼠李糖乳杆菌。这些菌株与FMT实验中ES-Recip小鼠中显示丰度降低的菌株(图2M)进行了比较，包括金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌和无乳链球菌。我们每周两次用选定的细菌接种SPF级C57BL/6小鼠(图4A)，并接受高剂量全身照射(8.2~8.5Gy)。接种毛螺菌的小鼠存活率和临床评分都显著提高(图4B-E)。给予粪肠球菌和鼠李糖乳杆菌可使存活率提高40%~60%(图4B)。与BHI组对照，给小鼠灌胃脆弱类杆菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌和无乳链球菌无改善效果(图4B和C)。
毛螺菌受体(Lachno-Recip)也显示出骨髓细胞密度和白髓和红髓区域脾脏恢复的显著增加(图4F)。对照组小鼠表现出更多的结肠隐窝变形、萎缩和更大的隐窝底部和粘膜肌层之间间隙 (图4G)。相比之下，给予毛螺菌的小鼠的隐窝仍然紧密地附着在粘膜肌层上。给予BHI的对照组小鼠的肠道绒毛短且平，给予毛螺菌后缓解(图4G)。异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖试验表明接受毛螺菌的小鼠的肠道通透性较BHI对照组有所降低(图4H)。
图3 肠道微生物区系与患者和小鼠的辐射防护显著相关
(A和B)21例白血病患者在全身放疗开始时采集粪便样本。(C)SPF级C57BL/6小鼠接受高剂量全身照射，监测时间>120天。(D)存活率(实验1中n=25，实验2中n=27)。(E)PCA图。(F)毛螺菌科和肠球菌科的相对丰度。
图4 给予毛螺菌可改善辐射诱导的症状
(A)细菌转移实验图解。(B和C)存货率(B)和临床评分(C)。(D和E)毛螺菌转移实验中，小鼠的存活率(D)和临床评分(E)。(F)取股骨和脾脏进行HE染色，并对骨髓细胞数和脾髓外造血评分进行定量。(G)照射后第1天收集结肠和小肠。(H)照射后第1天测定肠道通透性。
4. 辐射防护作用的代谢物介质
毛螺菌科以其通过发酵膳食多糖合成短链脂肪酸(SCFAs)的能力而闻名。SCFAs是维持肠道上皮、调节免疫系统和炎症反应的重要底物。SPF级C57BL/6小鼠接受醋酸、丁酸或丙酸治疗，并给予8.0至8.2Gy的全身照射(图5A)。对照组和丙酸治疗组的30天存活率分别为28%和79% (图5B和C)，而醋酸盐和丁酸盐作用较温和(图5B和C)。组织学分析显示丙酸治疗导致骨髓细胞数增加，脾脏呈白色和红色(图5D)。丙酸减轻辐射诱导的粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)、普通髓系祖细胞(CMPS)和巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的丢失(P<0.0 5或P<0.0 0 1)，但对粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)、普通髓系祖细胞(CMPS)和巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的丢失无明显影响(图5E)。此外，阿尔新蓝和高碘酸希夫(AB/PAS)染色显示丙酸治疗小鼠粘蛋白糖蛋白的粘液厚度和隐窝长度较对照组有所增加(图5F)。
我们研究了SCFAs是否通过减轻DNA损伤和电离辐射产生的活性氧(ROS)的释放来介导小鼠的辐射防护。SCFA治疗加给予大剂量全身照射(8.4Gy)，24h后分离出原代小肠上皮细胞、肠上皮内淋巴细胞和骨髓干细胞。Western blot检测包括γH2AX在内的 DNA损伤相关蛋白的水平(图5G)。丁酸和丙酸治疗组的胃肠道和造血组织中这些标记物的磷酸化程度都降低了。辐射后骨髓干细胞的细胞内ROS水平显著增加(图5H)，而丁酸盐或丙酸将其降低了50%至60%，这是在未接受辐射的幼龄小鼠中发现的。最后因为毛螺菌的存在提供了长期的保护，我们发现丙酸具有大于400天的保护作用(图5I)。
为了确定SCFAs以外的代谢物是否具有辐射防护益处，我们对“精英幸存者”和老龄对照小鼠的粪便样本进行了非靶向代谢组学研究。总离子色谱、代谢云图和PCA图显示“精英幸存者”和对照组之间的代谢物特征非常不同(图6A和B)。从这两组小鼠之间改变的3787个离子特征中，我们识别出141个显著改变的代谢物。“精英幸存者”粪便中浓度最高的代谢物聚集在色氨酸代谢途径中，吲哚3-甲醛(I3A)的水平变化了5倍，犬尿酸(KYNA)的水平变化了8倍(图6C和D)。他们在体内测试了两种代谢物的放射减量作用，发现这两种代谢物都能显著提高接受放射治疗的SPF小鼠的存活率并降低临床评分(图6E-G)。I3A和KYNA处理组的存活率均为75%，辐射后保护作用持续时间大于200天(图6H)。
图5 共生相关的短链脂肪酸(SCFAs)抑制辐射诱导的死亡和损伤
(A)SCFAs治疗示意图。(B和C)生存率(B)和临床评分(C)。(D) 股骨和脾脏用HE染色并定量，如图4F所示。(E)骨髓造血祖细胞的流式细胞术分析。(F) 结肠AB/PAS染色的代表性图像。(G)放射暴露24h后分离出肠上皮细胞、肠上皮内淋巴细胞和骨髓干细胞。(H)检测骨髓干细胞内活性氧(ROS)水平。(I)与对照组相比，照射后丙酸组的长期存活率被监测了400天以上。
图6 非靶向代谢组学显示色氨酸代谢物是有效的辐射防护剂
(A和B)粪便代谢物的总离子色谱代谢云图(P<0.01)(A)和PCA图(B )。(C)生物化学背景下的代谢物集合富集分析，确定和解释代谢物。(D)所有检测到的代谢物的代谢网络、综合生化途径和化学关系。(E)色氨酸代谢物处理示意图。(F和G)生存率(F)和临床评分(G)。(H)与对照组相比，照射后色氨酸代谢产物的长期存活率被监测了200天以上。
讨论
我们发现肠道微生物及代谢网络可以为小鼠抗辐射损伤提供有效的保护。我们的研究表明毛螺菌和肠球菌的存在与造血功能的恢复和胃肠道修复有关。这两个细菌类群在接受放射治疗的有轻度胃肠功能障碍的白血病患者中也更丰富。丙酸盐以及两种色氨酸途径代谢物I3A和KYNA在“精英幸存者”中含量升高，为小鼠提供了长期的抗辐射保护。本研究表明肠道菌群及其代谢产物可对急性和迟发性辐射损伤提供促进生命的辐射防护（图7）。
毛螺菌及其微生物代谢物丁酸盐对结肠炎、食物过敏和移植物抗宿主病有改善作用。SCFAs是由远端肠道微生物对不可消化食物发酵代谢而成，可直接进入体循环在外周组织中发挥信号分子的作用。我们的工作表明SCFAs可以直接促进造血和放疗后肠道修复，也可通过降低促炎细胞因子水平或诱导抗炎细胞因子白介素-10广泛抑制全身炎症提供放射保护。此外，本研究表明色氨酸代谢物I3A和KYNA对急性辐射综合症或疾病有保护作用。非靶向代谢组学结果显示在辐射幸存者中色氨酸代谢升高。色氨酸代谢物可以直接减少辐射引起的损伤，也可以减弱促炎细胞因子的反应。除了色氨酸代谢物，我们还发现“精英幸存者”中其他代谢物家族的升高。未来的研究需要研究这些化合物是否也有辐射防护作用。
针对辐射暴露的不良副作用的治疗选择有限且昂贵，我们的研究为进一步的深入研究描绘了光明的前景。
图7 辐射幸存者的多组学分析鉴定具有辐射防护作用的微生物和代谢物