科研 | Food Chemistry：转录组学与代谢组学揭示调亏灌溉对赤霞珠葡萄浆果花色苷生物合成的影响（国人作品）
编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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花色苷是葡萄的重要水溶性颜料，主要存在于浆果和细胞液中，它们对葡萄果实的颜色起决定性作用。对葡萄酒外观的评估通常是品酒的第一步，而颜色则决定了消费者对其的第一印象。因此，酒的颜色是必不可少的质量指标，主要受花色苷的影响。葡萄浆果中花色苷类型和含量的差异不仅影响最终葡萄酒的质量和风格，而且还导致葡萄酒的质量潜力及其商品价值。更重要的是，花青素也是重要的营养成分，具有很高的抗氧化能力，对葡萄酒的健康功能有很大贡献。植物根系吸收养分以促进植物生长，其能力受土壤因素影响，通过管理灌溉系统，可以调节土壤状况，以帮助植物根部吸收养分，找到不同植物的最佳灌溉量不仅可以进一步控制植物对养分的吸收，而且可以提高果实品质，这对于食品行业来说非常重要。调节亏缺灌溉(RDI)是近年来开发的一种新型节水灌溉技术，在减少用水的情况下，RDI的应用可以在一定程度上提高园艺作物的经济系数。目前，RDI已广泛用于酿酒葡萄生产中，可以显著改善葡萄栽培系统的生态和经济效益，一些研究人员认为缺水会导致植物内源激素水平发生变化，从而影响植物的新陈代谢。水分胁迫信号通过植物根产生的脱落酸传递到叶片，从而导致叶片上的气孔孔径改变，最终减少蒸腾作用。为了提高水分利用效率和控制生殖生长，已证明脱落酸可以诱导和增强植物根中水通道蛋白的活性，或可能发挥类似于水通道蛋白的作用。一些研究人员认为，脱落酸本身可以用作调节植物水分管理的信号分子。内部因素和外部因素共同影响花色苷的生物合成，内部因素包括品种，激素水平，糖分积累水平等。葡萄的遗传特性决定了不同品种之间花色苷含量和种类的巨大差异，糖是次生代谢产物的重要基础。花青素生物合成的前体来源于糖酵解。花色苷生物合成的大多数结构基因和调节基因都受糖的调节，葡萄浆果中的糖在花色苷的生物合成中也起着重要作用。外部因素包括水，光照，温度，耕作措施，土壤组成等。研究人员发现，遮光处理后葡萄果实中的花色苷含量降低。还发现在对葡萄进行遮光处理后，总花青素中的翠菊素，翠菊素衍生物和相应的酰化花色苷比例有所增加。花期期间的高温会严重影响花色苷的生物合成，导致葡萄色素的积累困难，而夜间的低温会促进花色苷的生物合成。先前的研究表明，RDI可能导致葡萄卷须脱落，新芽停止生长。适度的水分亏缺可以使葡萄中的总花色苷含量增加30％至50％，并改善花色苷的甲基化程度以及甲基化花色苷在总花色苷中的比例。但是，尽管对这些生化指标进行了许多研究，但到目前为止，仍缺乏关于赤霞珠葡萄中花色苷生成机理的系统研究，这对于弄清赤霞珠葡萄的机理非常重要。RDI对花色苷的影响，因此，本研究的目的是利用赤霞珠浆果中的生化和转录组学与代谢组学相结合，阐明RDI对花色苷生物合成和代谢的作用机理，以提供更多的证据来阐明RDI处理后的花色苷代谢途径。希望可以从综合组学的角度解释RDI的作用，并为酿酒葡萄的生长提供理论依据和指导。
论文ID
原名：Transcriptomics integrated with metabolomicsreveals the effect of regulated deficit irrigation on anthocyanin biosynthesisin Cabernet Sauvignon grape berries
译名：结合转录组学与代谢组学揭示了调亏灌溉对赤霞珠葡萄浆果花色苷生物合成的影响
期刊：Food Chemistry
发表时间：2020.1.6
影响因子：5.399
通讯作者：房玉林
通讯作者单位：西北农林科技大学酿酒学院
DOI号：10.1016/j.foodchem.2020.126170
实验设计
葡萄园中的植物是7年的赤霞珠葡萄，其框架类型为VSP。用滴灌带将株距定为1.0m×3.0 m，修剪方法是捷径。葡萄园有6个雨棚(每个雨棚3排葡萄藤，每排5块，每个雨棚总共75株葡萄藤)。随机选择了2个庇护所中的6行葡萄藤进行RDI处理。实验设置了三个治疗组，即RDI1，RDI2和CK组。从葡萄出土到收获前30天，分别根据估计的蒸散量(ETc)浇水。用30％ETc(RDI1)，50％ETc(RDI2)和100％ETc(CK)浇灌葡萄。根据滴灌的时间控制灌溉量，并通过以前的研究方法计算每个物候期的灌溉量。通过控制灌溉时间来控制灌溉量，因为葡萄藤每棵植物接受两个2.4 L/h滴头的灌溉水，并通过ETc计算灌溉量。通过在中午使用压力室测量叶片水势(ψmd)来监测葡萄的水分状况。使用Pennman-Monteith模型计算ETc，在开花(WAF)后第8、10、12、14和16周，每个重复取样500个浆果，每个处理组重复3次。随即，随机选择了足够数量的浆果，以测定百浆果重量，降低糖含量，总酸含量，可溶性固形物含量和采样后果汁的pH值。将所有用于HPLC-MS，qRT-PCR，转录组学和代谢组学分析。
结果
1 RDI对葡萄浆果理化指标的影响
图1A显示了在不同的RDI处理下葡萄的百粒重。从图1A可以看出，ETc含量为30％的RDI1组比CK组更能减慢果实重量的生长并阻止其生长。两组之间在WAF 14时发生了显著差异。由于葡萄成熟时严重缺水，RDI1(105.19 g)和RDI2(113.73 g)组的果实重量显著低于CK组(127.49 g)，分别下降17.49％和10.79％。
2. 葡萄的DEG和转录组分析
大规模RNA深度测序代表了研究转录调控的另一种技术平台，该平台可精确阐明特定样品中存在的转录本。基于绝对转录本丰度，可以计算基因表达。以前的研究已经进行了分析，在葡萄浆果的四个发育阶段。基于这些研究，在RDI下对赤霞珠浆果进行了转录组分析。根据图1F的分析，花色苷迅速积累的原因是8-12 WAF。因此，从每个处理组中随机选择10 WAF的葡萄浆果进行转录组学分析。图2A显示了治疗组和生物学重复之间的相关性，当该值接近1.00时，相关性更好。因此，该图可以直接反映不同治疗组之间的显著差异，并且分组很明显。图2B示出了DEG在RDI和CK基团的不同组合之间重叠。RDI1和CK组之间有3991个DEG，RDI2和CK组之间有1198个DEG，其中包含551个相同的基因。
图2.转录组学数据的初步分析。
绘制火山图以直观地表示每个RDI治疗组和CK组之间的差异基因分布。如图2C和图2D所示，绿点表示表达基因下调(倍数变化，Log2FC≤0.5)，红点表示表达基因上调(Log2FC≥2)，黑点表示无差异表达基因(0.5<Log2FC<2)。横坐标表示差异表达倍数，纵坐标表示基因重要性的差异水平。根据转录组分析结果，RDI1和CK之间存在3991个DEG，其中1687个上调而2304个下调。RDI2和CK之间共有1198个DEG，包括403个上调基因和795个下调基因。转录组分析结果表明，RDI影响了赤霞珠赤霞珠中大量基因的表达，DEG的数量随着水分亏缺的加深而增加。筛选了位于类黄酮生物合成途径下游的大多数花色苷合成基因。然后，将表达水平归一化，并在每个热图中每个处理产生三个生物学重复，产生两个“ DEG1 CK vs RDI1”和“ CK vs RDI2”的DEG簇热图(图2E和F)。在两个图中，RDI1和CK组之间的差异更为显著。在10 WAF时，Vv4CL和VvFAOMT基因显著下调，而VvUFGT，VvGDH， VvC4H，VvLDOX和VvF3H在RDI1中表达显著上调。在图2F中，不能直接确定RDI2和CK基团的每个重复之间的差异，这仍然需要进一步分析。通过GO分类将该实验中的差异基因分为分子功能，细胞成分和生物学过程三类，并作图，如图3A和B所示。在生物学过程中，共有1391(34.85％)个DEG RDI1和CK之间的代谢过程与415个(34.64％)DEGs与RDI2和CK之间的代谢过程相关。可以看出，不同程度的RDI会极大地影响葡萄细胞中参与代谢过程的DEG的数量，但参与代谢的DEG的比例与总DEG相似。
3. 花色苷生物合成基因的表达
为了确定赤霞珠赤霞珠中RDI对花色苷生物合成的影响，需要进一步检查转录组学分析结果。对花色苷生物合成途径中的8个关键基因的相对表达水平进行了RT-PCR：VvPAL，VvC4H，VvCHS，VvF3’5’H，VvF3’H，VvDFR，VvLDOX和VvUFGT(图4)。在8WAF至14 WAF时，两个RDI组中VvPAL的表达均显著高于CK组，并且在14WAF时差异达到最大值。相对转录水平的差异在“ CK vs RDI1”中为6.43，在“CK vs RDI2”中为3.29。但是，在成熟期间(16 WAF)，两个RDI组中该基因的表达水平显著低于CK。在验证开始时(8 WAF)，VvC4H的表达达到最大值，而“CK vs RDI1”的差异倍数为3.59，而“ CK vs RDI2”的差异倍数为4.71。随着果实的成熟，VvC4H的表达逐渐降低。在成熟阶段(16 WAF)，RDI组的VvC4H表达低于CK组。VfF3’5’H的表达在8 WAF的严重RDI处理(RDI1)下显示出较大的上调，“ CK vs RDI1”的差异倍数为23.14。在严重的RDI处理下，另一个基因VvUFGT的表达也显示出较大的上调，“ CK vs RDI1”的差异倍数达到17.04。在8WAF时，两个RDI组中VvLDOX的表达明显低于CK组。然后，在10WAF时，该基因在RDI1组中显著上调，这在基因水平上是对RDI处理的一种反馈，仍然需要对其机理进行进一步分析。
当葡萄缺水时，花色苷生物合成途径中的8个关键基因在不同时期表现出不同程度的表达变化。验证VvPAL，VvC4H，VvCHS和VvDFR上调，但在成熟期间下调。在开始验证时，VvLDOX的表达下调，然后逐渐增加，直到果实成熟。不同的基因对水分亏缺的反应不同，并且具有该反应的葡萄的物候期也不同。由于缺损程度的不同，同一时期的同一基因也将有不同的表达。先前的研究表明，葡萄浆果中的其他物质也对花色苷结构基因有影响，因为浆果中的花色苷含量通常与糖含量呈正相关。葡萄糖和果糖的增加促进了VvDFR的表达，因此，花青素途径中的VvDFR基因在RDI1处理后表现出上调的表达。这不仅可能是由于缺水直接调节VvDFR基因，还可能是由于在RDI的作用下，葡萄糖和果糖的生物合成和积累所涉及的基因和酶的上调，从而调节VvDFR的表达，葡萄糖类似物如2-脱氧葡萄糖和甘露糖也可以诱导花青素的积累。糖分蛋白合成基因VvHT1能够转运半乳糖，木糖，葡萄糖和3-葡萄糖苷，并且VvHT2和VvHT3的表达具有很强的时间特异性，特别是在验证过程中VvHT3会上调，这也证实了变化RDI处理后碳水化合物代谢途径中的糖基化可能会导致花色苷的变化。除本研究涉及的花色苷生物合成途径中的结构基因外，MYB家族转录因子作为调节基因也是对花色苷生物合成产生重大影响的最重要的转录因子。同时，由于其MYB基因的突变，在某些白葡萄品种中未检测到花青素积累。因此，在引起这项研究中代谢物积累变化的众多因素中，表达水平上转录因子的变化是可能的原因之一，本文未对此进行讨论，需要进一步研究和证明。
4. 葡萄的差异代谢产物富含花色素苷生物合成途径。
先前的研究表明，RDI可以导致成熟酿酒葡萄中各种花色苷的含量增加，但是花色苷上调的机理和具体细节仍然存在不清楚。因此，在中度(10 WAF)期间，赤霞珠的浆果中检测到多种单体花色苷，类黄酮和类黄酮醇，并在实验的这一部分进行了代谢组学分析。从图5A所示的主成分分析中，不同样品组的不同代谢物分组证明了代谢组学分析的下一步。在所有组比较中，每种组合中65种代谢物的含量均出现差异，总共18种代谢物表现出显著差异(图5B)。在进一步的分析中(图5C和D)，可以确定RDI1和RDI2组与CK组相比的差异代谢物数量(点数)，显著性(纵坐标)和差异倍数(横坐标)。RDI1有37个上调(Log2FC≥2)，1个下调(Log2FC≤0.5)和104个不清楚的变化(0.5<Log2FC <2)代谢产物。RDI2有30个上调，2个下调和100个不清楚的变化代谢物。总之，灌溉量与花青素相关代谢物的含量密切相关。上调的代谢物数量随着水分亏缺的增加而增加。
试验生成了34个单体花色苷和类黄酮的两个簇热图(图5E和F)。与CK组相比，RDI1显著上调了大多数花色苷的含量，而某些花色苷前体(如对香豆酸，二氢槲皮素和二氢杨梅素)的含量则显著下调了三份。在RDI2组和CK组之间的比较中，上述三种前体的含量仍然显示出明显的下调，而类黄酮(如芦丁)的含量也被类似地下调，表明在RDI处理过程中，花色苷生物合成途径中许多花色苷和类黄酮的含量均发生了显著变化，尤其是在缺水最严重的RDI1组中。RDI处理对葡萄皮中单体花色苷的影响为了更准确地验证代谢组学的结果，确定了从开始发酵(8 WAF)到成熟(16 WAF)期间葡萄皮中五种主要单体花色苷的含量。这五个单体花色苷是花青素3-O-葡萄糖苷(Cy)，飞燕草素3-O-葡萄糖苷(Dp)，peonidin-3-O-葡萄糖苷(Pn)，矮牵牛苷-3-O-葡萄糖苷(Pt)和麦维汀-3-O-葡萄糖苷(图S2)。在每个处理组中，随着葡萄的成熟，Cy的含量逐渐增加，而在8 WAF时，Cy的含量较低。Mv含量的变化在很大程度上影响了葡萄中TAC的变化,三个处理组的My含量随果实发育而增加。在进行了代谢组学分析的10 WAF的葡萄中，CK组的Mv含量为3.03 mg/g。RDI1组的Mv含量为6.22 mg/g，是CK组的Mv含量的205.28％。RDI2组的Mv含量为5.70 mg/g，是CK组的188.12％。在12-16 WAF期间，RDI1和RDI2组的My含量略有增加，而CK组的My含量基本保持不变。当葡萄成熟时，三个处理组的Mv含量分别为8.68mg/g，8.09 mg/g和5.71 mg/g，分别占非酰化花色苷含量的45.54％，44.22％和38.03％。在RDI1组中，Mv的比例最高。在花色苷的检测和分析中，可以发现，在果实成熟的早期(14-16 WAF)，各种单体花色苷含量迅速下降，这种现象可能是由于下游代谢反应的激活引起的。在RDI处理的情况下，大多数单体花色苷积累更快，花色苷含量达到最大值的时间增加。少数单体花色苷(如Pn)对RDI不敏感。因此，总蓄水量和趋势与正常灌溉组相似。可以发现，单体花色苷含量与代谢组学分析结果之间存在显著相关性，代谢组学测试结果可以用10 WAF下葡萄中花色苷含量的变化来具体解释，因此，赤霞珠不仅在RDI处理期间的花期期间花色苷含量增加，而且在成熟期间花色苷含量也仍然显著高于正常灌溉组。
6. RDI处理对花色苷生物合成途径的影响
结合转录组学和代谢组学数据，试验清楚地看到不同程度的RDI处理对整个花色苷生物合成途径的不同影响(图6)。在该途径的上游，两个RDI组中的1-苯丙氨酸含量与CK组相比没有显著变化，并且VvPAL基因产生的肉桂酸含量显示出明显的上调。随后，在VvC4H，Vv4CL和VvCHS的作用下产生了柚皮苷，在此过程中RDI1组显示出明显的上调。此外，两个RDI组中柚皮苷的含量均略有上调，而RDI1组则有较大的上调。此后，柚皮素在VvF3’5’H和VvF3’H的作用下产生了雌黄醇和二氢三叶草素。在两个RDI组中，雌三醇的含量也有不同程度的增加，并且RDI1组的上调程度更大。DHK，DHQ和DHM是三种类黄酮柚皮素，顺丁烯二酚和二氢三羟黄酮的下游产物，与其他物质不同。RHK1组中DHK的变化不明显，RDI2组中DHK的变化略有增加。在两个RDI组中，DHQ的含量均略有下降，并且DHM含量显示出明显的下调，而在两个RDI组中，影响该过程的VvF3H的表达被上调。在三种基因VvDFR，VvLDOX和VvUFGT的作用下，上述三种二氢黄酮醇依次产生了多种花色苷。其中，VvLDOX在RDI1组中显著上调，而VvUFGT基因在两个RDI组中均上调。对图6所示代谢途径的分析显示，在两个RDI组中，作为delphinidin代谢途径下游产物的MV，Pt和Dp的单体花色苷含量均显著增加。与其他单体花色苷相比，由于Mv在花色苷总量中所占比例最大，因此推测TAC的大幅增加是由于缺水条件下Mv含量的急剧增加所致。但是，作为Mv，Pt和Dp的上游前体，两个RDI组中DHM的含量均显示出明显的下降趋势，这似乎是矛盾的结果，这可能是由于上游代谢物二氢蝶呤的含量较低或分解所致。
讨论
根据试验数据，已经揭示了RDI对赤霞珠葡萄浆果中花色苷生物合成的影响。RDI增加了可溶性固形物含量，果汁pH值，降低了糖含量和总花色苷含量，但略有降低了百粒重。总酸含量在成熟前下降，RDI1组和CK组之间的差异最大。转录组学和代谢组学分析表明，RDI组中过滤了许多DEG和SCM，并且随着水分亏缺的增加，其数量也增加。在ETc灌溉量为30％的葡萄中，花色苷生物合成途径中关键基因的相关表达水平上调，例如VvPAL，VvC4H，Vv4CL，VvCHS，VvF3’5’H，VvLDOX和VvUFGT；然后，肉桂酸，柚皮苷查尔酮，柚皮苷和雌黄醇等代谢物的含量在该途径中显著增加，大多数单体花色苷的含量增加并且比例改变。随着灌溉量的减少，Mv的比例增加。试验分析揭示了RDI影响花色苷生物合成的机制，这项研究的结果为进一步研究水调节花色苷积累奠定了基础。这样的研究最终将有利于RDI措施的推广，试验数据可能对提高酿酒葡萄的质量有用。
结论
调节亏缺灌溉(RDI)是近年来开发的一种新型节水灌溉技术，非常适合干旱和半干旱的葡萄种植区。在这项研究中，通过组学方法揭示了RDI下葡萄花色苷的合成。RDI略微降低了百粒重，并增加了可溶性固形物含量，果汁pH值，糖含量和总花色苷含量。同时，总酸含量在成熟前下降。转录组学和代谢组学分析表明，在RDI组中过滤了大量差异表达基因(DEG)和显著变化的代谢物(SCM)。含30％ETc的RDI1上调了花色苷生物合成途径中的7个相关基因表达水平，并且还增加了一些代谢物的含量。最终，RDI组中大多数单体花色苷的含量增加，而RDI组成熟葡萄中的Mv比例增加。总之，RDI是一种有用的节水灌溉方法，也可以增加葡萄中的花色苷含量。
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