科研 | Cell Reports: IL-33信号改变支持肿瘤发展的调节性T细胞多样性（单细胞转录组）

编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。

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导读

调节性T细胞（T_regs）可损害抗肿瘤免疫反应，并与多种癌症类型的预后不良相关。人类肿瘤中的T_reg具有不同于外周T_reg的多种转录状态，但它们对肿瘤发展的作用尚不清楚。本文中，研究者使用单细胞RNA测序（RNA-seq）对肺腺癌基因工程小鼠模型中T_regs分布的动态变化进行纵向分析。在这个模型中，干扰素反应的T_regs在肿瘤发展早期更为普遍，而以IL-33受体ST2表达增强为特征的特异性效应表型在晚期疾病中占主导地位。ST2的T_reg特异性缺失改变效应器T_reg多样性的演变，增加CD8⁺T细胞向肿瘤的浸润，减轻肿瘤负担。研究表明，ST2在T_reg介导的肿瘤免疫抑制中起着关键作用，这突出了治疗干预的潜在途径。

论文ID

原名：IL-33 Signaling Alters Regulatory T Cell Diversity in Support of Tumor Development

译名：IL-33信号改变支持肿瘤发展的调节性T细胞多样性

发表时间：2019年12月3日

期刊：Cell Reports

IF：8.04

通讯作者：Aviv Regev & Tyler Jacks

作者单位：美国麻省理工学院

研究示意图

结果

单细胞RNA测序显示肿瘤相关的 CD4+ T_convs和 T_regs的肺特异性转录程序

与之前报道的KP肿瘤发展过程中肺Tregs扩张相一致，流式细胞术检测的Ki-67⁺ Treg在早期肿瘤的肺中的比例升高（图1A），而Ki-67⁺ T_convs的比例在5周和8周时略有增加，但在12周时恢复到基线水平（补充图1A）。研究者假设Treg的早期增殖可能与Treg多样性的变化有关，然后使用scRNA-seq来描述肿瘤相关CD4⁺T细胞随时间的异质性以及T_reg与T_conv多样性之间的关系。此外，研究者接着对肿瘤诱导后一段时间的非荷瘤和荷瘤KP、Foxp3^GFP小鼠的肺和纵隔淋巴结（msLNs）进行了全长的scRNA序列1254 T_convs和1679 T_regs分析（图1B）。

组织特异性程序包括肺T_convs和T_regs共有的基因以及每种基因中唯一上调的基因（图1C）。与msLN T_regs相比，肺T_regs表达较高水平的Il1rl 1、Cxcr 4、Areg和Klrg 1，而T_convs则表达Cd 44、Ccr 4和Itgb 1（图1C）。与最近描述的组织驻留T_regs转录轨迹相关的基因程序与研究中的肺细胞的单细胞RNA测序谱所强调的基因程序一致。msLN的T_regs和T_convs表达与初始或中央记忆表型相关的基因，包括Lef1、Sell和Ccr7，而肺细胞则更为活跃。msLN标记得分高的肺T_conv和T_regs的亚群中也表达了与T细胞受体（TCR）信号传导相关的基因，包括Nr4a1和Junb，这表明它们可能被就近激活（图1C）。

肺细胞和msLN细胞都具有不同的细胞状态，肺细胞表现出较高的多样性。当肺和msLN标记基因被用来创建扩散映射图时，这点是很明显的（图1D和补充图1D）。

肺T_conv和T_regs 亚群共享有限数量的表达程序，包括一个Th17样的表型

为了评估T_conv和T_reg亚群在肺组织中的不同转录程序，研究者用PAGODA技术鉴定了共变异表达的基因组。在肿瘤发展过程中，表达不同T_conv程序标记的细胞的相对比例保持稳定。T_conv和T_reg亚群表达了若干重叠的程序，包括与初始/静止T细胞和IFN信号相关的程序（图1E）。

图1：scRNA-Seq 显示特有的肺CD4⁺ T细胞特征及重叠T_conv和T_reg多样性

在与效应CD4⁺T细胞亚群相关的Tconv程序中，只有Th17程序与T_reg程序相关。程序13标记表达Rorc和Il17a的T_reg，让人想起Th17样效应因子T_regs（Tr17），被认为抑制Th17反应。通过流式细胞术，RORγ t+T_regs在整个肿瘤发展过程中占肺T_regs的不到10%。程序13和肺T_reg信号基因的表达呈负相关，提示Tr17样细胞代表一种不同的状态（图1E，补充图1H、1I、1J和1K）。

值得注意的是，T_regs和T_convs共有的TCR克隆型主要是Tr17样和Th17样细胞，T_regs和T_convs共有12个TCR克隆型。在这些共有TCR克隆型的19个T_regs和20个T_convs中，13个T_regs是Tr17样的（图S1L和S1M）。由于鉴定的克隆型家族数量较少，因此无法可靠地检测出时间趋势。总的来说，这表明Tr17分化可能反映了与Th17细胞共同的克隆起源。

Klrg1⁺ Areg⁺ 类效应性 T_reg 程序在肿瘤发展期间成为主导程序

与Tr17样细胞相比，其他Treg程序随着时间的推移而显著改变，Tr17样细胞在肿瘤发展过程中占肺T_reg的固定比例。8周后，标志细胞周期的程序1、3、8和9的表达减少，与之相一致的Ki67+T_regs也减少。另外两个程序也随着时间而改变，反映了IFN响应（程序6和23）和Klrg1⁺Areg⁺（KA）类效应性程序（程序12和21）（图2A-2C）。

IFN反应性T_reg程序（“IFNstim_TR”）包括许多IFN刺激基因（ISGs）下游的I型或II型IFN信号。在肿瘤进展过程中，来自IFNstim_-TR项目的28个基因在T_regs中显著下调。IFNg促进T-bet⁺CXCR3⁺T_reg群体，抑制Th1反应。Cxcr3和Tbx21都不是IFNstim_-TR基因，但IFNstim_-TR表达与Tbx21表达相关。此外，细胞IFNstim_-TR程序评分很高，同时，淋巴组织T_reg程序评分也很高。综上所述，表达IFN应答程序的T_regs（“IR T_regs”）在肿瘤发展早期和msLNs中最为普遍，因此可能最近到达肺部（见原文补充图2C-2F）。

图2：在肿瘤发生过程中Klrg 1⁺Areg⁺ T_reg表型成为主导

同时，Klrg1⁺Areg⁺类效应T_reg程序（“KA_TR”）包括小鼠非淋巴组织和人类癌症T_reg中上调的基因。表达KA_TR程序的T_regs（“KA-T_regs”）表达Ccr6，而不是Cxcr3，代表一个不同于IR-T_regs的群体。Klrg1和Areg的表达分别与T_reg分化和组织修复有关。晚期KP小鼠40%的肺T_regs显示为CD103⁺KLRG1⁺。KA_TR程序富含在DP T_reg中上调的基因，包括与T细胞激活和一般认为的T_reg效应功能相关的基因（如Nr4a1、Cd69、Il1rl1、Areg、Srgn和Fgl2）。KA和DP Treg高度相似，可能代表KLRG1⁺效应T_reg群体（补充图2E，2G-2I）。

IR和KA-T_reg程序在每个时间点表现出不同的T_reg表型，并遵循相反的时间模式：IFNstim_-TR基因在细胞中的表达从第5周开始最高，此后下降，而KA_TR基因的表达增加并保持升高。这一趋势反映在单个基因上：Cxcr3表达下降，而Pdcd1和Lilrb4在肿瘤发展过程中表达增加。一般来说，在DP T_regs中，KA_TR基因上调，而Cxcr3和IFNstim_-TR基因显著下调。事实上，在肿瘤发展过程中，CXCR3蛋白水平降低，由KA-TR基因编码的蛋白（包括CD85k、CD69、CXCR6、PD-1和ST2）增加。总之，本研究数据表明肿瘤发展可能与从IR程序向KA-T_reg程序的转变有关。研究者猜想与晚期肿瘤相关的免疫抑制可能是由于KA-T_regs的强势有关（图2A-2D，补充图2H，2J和2K）。

ST2可能促进晚期肺癌小鼠KA Treg表型

Il1rl1是一个编码白细胞介素-33（IL-33）受体ST2的KA_TR基因，它标志着一个具有较高KA_TR基因表达的异质T_reg群体。ST2在DP肺T_regs中表达最高，与先前的数据一致，ST2标记表达KLRG1和GATA3的组织T_reg程序。Il1rl1⁺和Il1rl1^- T_regs都包含了细胞状态的全谱，具有相似的转录多样性。然而，Il1rl1⁺T_regs具有较高的KA_TR和DP基因表达和较低的Th17样和无变化的T_reg基因表达。Il1rl1⁺T_regs在非荷瘤肺中的IFNstim_-TR基因表达也低于Il1rl1^-。Il1rl1⁺和Il1rl1^- T_regs在细胞周期基因和Ki-67中有相似的表达，提示细胞增殖并不能解释所观察到的表型差异。人类结肠癌Il1rl1⁺和Il1rl1^-T_regs之间差异表达的基因也因KA_TR基因而丰富。因此，ST2信号可能是人和小鼠T_reg中的一个保守途径，促进KA/DP T_reg表型和/或KA/DP T_regs增殖。与ST2信号在肿瘤发展过程中的存在一致，IL-33，ST2唯一已知的配体，在正常肺和KP早期和晚期肿瘤中高表达。IL-33主要表达于正常肺的AT2细胞和含瘤肺的AT2及间充质细胞，这与以往报道一致（图3A-3D）。

图3：肺部荷瘤小鼠中ST2标记各种各样的群体KA/DP T_regs

ST2蛋白在肿瘤发生的晚期以肺T_regs中表达为主。ST2在肺T_regs中的表达随时间增加而增加，且ST2主要由T_regs表达，CD8⁺ T细胞和T_convs表达较低。研究者猜想ST2⁺T_regs的扩增可能在肺癌发展过程中驱动KA/DP T_regs的增加（图2D，补充图3E和3H）。

在肿瘤发展过程中，DP T_regs的增加需要T_reg特异性的ST2

为了测试ST2信号是否有必要发展KA/DP T_reg反应，研究者研究了T_reg特异性的Il1rl1缺失的影响。研究者使用了一个改良的KP模型，其中FlpO重组酶诱导癌基因K-ras的表达和p53的缺失(KPfrt: FSF-Kras^G12D, p53^frt/frt)，其允许研究者使用Cre-lox系统删除T_regs中的Il1rl1。研究者将KPfrt和Foxp3^YFP-Cre，Il1rl1fl/fl小鼠杂交，在T_reg特异性ST2缺乏的情况下建立肺腺癌模型，并用表达FlpO重组酶和GFP融合到Ova和SIYRGYYL（FlpO-GFP-OS）的慢病毒感染小鼠，以诱导肿瘤表达与LucOS模型相同的T细胞抗原。结果显示：Il1rl1位点的T_reg特异性重组，CD8⁺T细胞和T_conv中ST2的表达并没有改变（图4A）。

早期KPfrt、Foxp3^YFP-Cre、Il1rl1^fl/fl（KPF-ST2^FL）和KPfrt，Foxp3^YFP-Cre（KPF）小鼠的T_convs和T_regs分数相似，但肿瘤进展晚期KPFST2^FL小鼠的T_regs比例较低，其中DP T_regs较少。值得注意的是，KPF和KPF-ST2^FL小鼠的DP T_regs具有相似的Ki-67表达，提示KPF-ST2^FL小鼠DP T_regs的减少部分不是由于增殖受损所致。msLNs和脾脏T_regs没有更少的DP T_regs。KPF-ST2^FL小鼠和对照组Th1、Th17、CD8⁺T细胞、肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞和肺泡巨噬细胞的比例也具有相似性（补充图4E-4H）。

KPF-ST2^FL和KPF小鼠的DP、SP和DN Tregs的整体RNA测序发现，KPF-ST2^FL和KPF T_regs的表达信号较低，KPF DP T_regs的表达信号最高。DP标记基因包括Dgat2、Furin和Nfkbia，在Il1rl1+Tregs中优先表达（p=1.2 X 10^-13）和T_regs上调的基因在NSCLC中得到了丰富的表达。KPF-ST2^FL T_regs还显示了Itgb1、Il10、Klf6和Fos等基因的高表达，提示它们可能采用不同的表型（图4D）。

图4：T_reg特异性ST2消除改变T_reg多样性，增加肿瘤CD8⁺ T细胞浸润

研究者假设KPF-ST2^FL小鼠可能改变了Tr17样和CXCR3⁺ T_regs的比例。事实上，与KPF小鼠相比，KPF-ST2^FL小鼠的CXCR3⁺CCR6^- T_regs增加，而CXCR3^- CCR6⁺ T_regs减少。然而，RORγt的表达没有改变，这表明KPF-ST2^FL小鼠CCR6⁺T_reg群体（不包括Tr17样细胞）减少。在肿瘤发生早期，KPF-ST2^FL小鼠的CXCR3⁺T_regs也增加了CXCR3的荧光强度。总之，研究的数据支持这样一个假设：ST2通过促进交替表型上的KA/DP T_regs来调节T_reg多样性（图4E）。

T_reg特异性ST2消除可增加CD8⁺ T细胞浸润，减轻肿瘤负担

KPF-ST2^FL小鼠肿瘤的CD8⁺ T细胞浸润率比KPF小鼠高50%，这造成CD8/T_reg比值较高。与对照组相比，KPF-ST2^FL小鼠的肿瘤负荷较低，肿瘤体积较小，这提示肿瘤中CD8⁺ T细胞浸润越大，对肿瘤生长的抑制作用越强。此外，在KPF-ST2^FL小鼠中，Foxp3⁺ T细胞的肿瘤浸润也比较明显，这支持了关于ST2信号缺失促进促炎性T_reg表型而不是减少T_reg数量的假设。总之，研究者的研究表明，T_reg特异性抑制ST2信号可能导致肿瘤微环境的免疫抑制作用减弱，其特征是抗肿瘤CD8⁺ T细胞活性增强，肿瘤负荷减轻。

讨论

T_reg特异性ST2缺乏小鼠的移植性和慢性炎症相关的肿瘤的生长受到损害。研究者在原癌基因驱动的肺腺癌小鼠模型中发现，T_reg特异性ST2的缺失改变了T_reg的多样性，增加了CD8⁺ T细胞浸润，这提示KA T_regs抑制了抗肿瘤CD8⁺ T细胞活性。肺CD8⁺ T细胞表达低水平的ST2，这提示观察到的表型不是由于CD8⁺ T细胞中ST2信号的增加引起。事实上，KPF-ST2^FL小鼠CD8⁺ T细胞的比例和表型与对照组小鼠相似，研究者的实验数据表明，阻断ST2信号在癌症中，特别是与改善CD8⁺ T细胞功能的其他免疫疗法相结合时，具有一定的潜在价值。

研究者观察到KPF-ST2^FL小鼠的肺T_regs轻微减少，这与IL-33能够刺激T_regs TCR独立扩张的报道一致。然而，研究并没有发现KPF-ST2^FL小鼠与对照组小鼠的T_regs之间的增殖差异。相反，由于IL-33信号的丢失，ST2缺乏的T_regs可能采用多种交替状态。最近有报道称，结肠ST2⁺ T_regs的Th17相关基因表达水平较低，重组IL-33能够抑制Tr17分化，而KPF-ST2^FL小鼠的RORγt⁺或IL-17⁺ T_regs比例不高。相反，IL-33信号的缺失有利于CXCR3⁺表型，KPF-ST2^FL小鼠的DP T_reg有低表达的DP基因，这提示ST2可能有助于调节KA/DP T_reg表型。IL-33已被证明能增加Foxp3和GATA-3的表达，这是和T_reg分化有关的非常关键的转录因子。KA/DP-Tregs在肌肉、肺和肿瘤中具有与先前描述的“组织保护性”Tregs相似的特征，为ST2介导的这些T_regs促进如何改善肿瘤的生长提供了依据。实际上，KA/DP T_regs表达一个类似于人类癌症T_regs的程序，包括人类非小细胞肺癌NSCLC中的TNFRSF9⁺ T_regs。

CXCR3将T_regs引导到Th1炎症部位，这可能解释了IFNstim_-TR程序在CD8+T细胞肿瘤浸润和IFN信号转导高峰的早期肿瘤发生过程中的重要性。CXCR3可能标志着新近到达的具有与KA T_reg不同功能的T_regs，IFNstim-TR和KA-TR基因表达的时间变化可能反映了T_reg对肿瘤微环境的适应。另外，在肿瘤发展过程中，由于IFN减少，即使IL-33仍然大量存在的情况下，CXCR3⁺ T_regs的下降可能反映了细胞的更替和/或KA T_regs的生长。与对照组相比，KPF-ST2^FL小鼠T_regs中CXCR3的表达增加，提示IL-33信号的缺失能够导致IFN信号的增强，这可能与IFNg的主要来源的CD8⁺ T细胞对肿瘤的浸润增强有关。CXCR3和CCR6的差异表达也表明，KPF-ST2^FL小鼠的T_reg定位可能发生改变，这与肿瘤中观察到大的Foxp3⁺细胞浸润程度一致。有若干报道描述了在人类肿瘤中的IFN信号或CXCR3+Tregs的独特群体，尽管它们的重要性还没有得到很好的定义。

KP模型中的纵向单细胞RNA测序scRNA-seq提供了一个了解肿瘤T_conv和T_reg多样性研究的窗口，这是利用大量人群或患者样本难以实现的。Tr17样、IFN应答和KA/DP效应的T_reg群体已经在人类肿瘤中被描述过；本研究表明这些状态同时存在，并且它们的相对比例随肿瘤的发展和ST2活性而变化。此外，在T_regs中ST2信号的丢失可以改变T_reg的组成并最终影响肿瘤的生长。尽管T_regs转录的异质性可能对肿瘤T_reg活性的靶向性提出挑战，但本研究证明了通过控制T_reg的多样性、成熟和功能的途径可能是未来治疗的一个非常有用的靶点。

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