科研 |MOL BIOL EVOL：病毒适应度决定植物防御响应的转录组和表观基因组重编程的程度
编译：YQ，编辑：景行、江舜尧。
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植物应激可通过识别病原体蛋白质或RNA分子而触发。病原体相关分子模式（PAMP）可引发寄主免疫反应（PTI），而病原体特异蛋白被NLR（胞内核苷酸结合位点）家族防御蛋白识别会启动更强的防御。效应器触发免疫（ETI）诱导植物过敏性反应（HR），限制病原传播。PTI和ETI都促进植物抗性相关激素和抗病蛋白（PR）蛋白的产生。
植物病毒防御系统通过DNA或组蛋白上的表观遗传标记调控基因表达，多数DNA甲基化标记与GC有关，也包括CHG和CHH（H表示任意核苷酸）。植物中的CG和CHG甲基化由甲基转移酶和染色质重塑因子DDM1维持，而RNA介导的DNA甲基化（RdDM）由两种植物特异性RNA聚合酶（Pol IV/V）、RNA沉默因子（RDR2、DCL3、AGO4），表观遗传因子（甲基转移酶DRM2）的复合物协调。研究表明环境胁迫改变DNA甲基化模式，然而RNA病毒对DNA甲基化的影响有待研究。快速进化的RNA病毒可通过突变体或编码特定蛋白质从而抵抗宿主免疫，称为RNA沉默的病毒抑制子（VSR）。
论文ID
原名：Viral Fitness Determines the Magnitude of Transcriptomic and Epigenomic Reprogramming of Defense Responses in Plants
译名：病毒适应度决定植物防御响应的转录组和表观基因组重编程的程度
期刊：Molecular Biology and Evolution
IF：11.062
发表时间：2020年7月
通讯作者：Régis L. Corrêa
通讯作者单位：西班牙瓦伦西亚大学
DOI号：10.1093/molbev/msaa091
实验设计
试验材料：拟南芥及其突变体nrpD1a-3、nrpE1、ibm1-4、jmj14、rdr2-1、drm1-2/drm2-2、ago4。TuMV分离株YC5作为病毒接种源，包括原始毒株和进化毒株。
转录组：HiSat2进行序列组装，bcftools进行SNP查找，DESeq2识别差异表达基因，TEtranscripts识别差异表达转座子。
表观基因组：Bismark-Bisulfite Mapper进行基因组组装，R包Methylkit识别甲基化及差异分析，GenomicFeatures进行功能注释。
结果
TuMV分离株YC5（原始毒株）在拟南芥中连续传代而进化（图1A）。该病毒源于马蹄莲，通过反复用新的宿主培养病毒种群，可进化出比原始毒株适应性更强的毒株（称为祖先分离株和进化分离株）。病毒接种7d左右叶片上出现早期症状（图1B-C）。而感染进化分离株的植物比被祖先分离株症状发展更快（图1C-D）。在感染早期阶段TuMV的积累水平没有显著差异，而当症状在分离株间明显不同时，进化分离株的浓度显著高于祖先分离株。通过RNA-seq比较祖先和进化分离株的基因组，在进化分离株中观察到两个SNP，导致氨基酸替换，影响病毒编码蛋白VPg，VPg是一种参与病毒复制、抑制寄主RNA沉默防御的功能蛋白。因此，连续传代可进化出适应性更强的TuMV分离株。
图1. 野生型拟南芥感染TuMV试验。A：TuMV在烟草内的连续传代；B：症状发展；C：感染祖先病毒和进化病毒的症状严重程度；D：显示严重症状的天数。
2 TuMV适应度影响拟南芥转录组响应
在拟南芥中接种祖先或进化TuMV分离株，在感染早期（5dpi）和感染晚期（12dpi）采集叶片提取RNA。结果显示感染进化病毒的样品差异表达基因的数量更大。进化病毒感染5d的差异表达基因数量是原始病毒的7倍，表明寄主对进化病毒的应答更强（图2A）。进化病毒对植株整体生理稳态形成更强的干扰，包括生物胁迫及转录因子相关基因的诱导（图2B），而且进化病毒感染样品中生物应激基因表达抑制，可能对病毒生存有利。差异表达基因中，WRKY转录因子在免疫响应发挥重要作用，其中WRKY70诱导水杨酸（SA）相关防御基因激活以抵抗病毒，而WRKY25是SA途径的抑制因子，表明SA缓冲机制可能存在于中晚期感染。在感染早期和晚期，观察到脱落酸（ABA）、乙烯（ET）和茉莉酸（JA）相关基因的差异表达（图2C）。PTI/ETI相关基因也存在差异表达，其中PR1变化最大（图2D）。
病毒是RNA沉默防御的目标，因此差异表达基因中大量RNA沉默相关基因被诱导表达，而DNA甲基化相关基因在病毒感染时表达抑制（图3A）。而且，感染进化病毒植株的表达水平明显低于祖先病毒，这表明表观遗传调控可能在病毒感染期间发生改变。由于表观遗传途径常以转座子为靶点，因此使用TEtranscripts工具分析转座子表达。在感染5d，Copia和Gypsy两类转座子在进化分离株感染的植物中诱导表达（图3B）。其中Gypsy ATHILA2处于着丝粒位置，该位点受温度变化和病毒感染调节。感染12d时，可同时观察到转座子的诱导和抑制，同样主要是Gypsy和Copia两类转座子，包括AtCOPIA93，一种诱导抗细菌和病毒感染的转座子。而被抑制的转座子则包括Helitron、Harbinger、Mutator家族，这些位点通常位于基因附近。DNA甲基化和组蛋白修饰基因以及不同家族转座子的差异表达表明表观遗传因素在感染过程中发挥作用。
图2. 野生型拟南芥对TuMV的转录组响应。A：差异表达基因数目；B：不同分离株感染植株的差异表达基因GO富集；C：植物激素相关基因表达转录谱；D：免疫基因表达转录谱。
图3. TuMV感染野生型拟南芥的表观遗传相关基因转录谱。A：RNA沉默和DNA甲基化基因转录谱；B：转座子差异表达。
3 TuMV适应度影响拟南芥表观遗传调节
本研究在DNA/组蛋白甲基化增强/减弱的拟南芥突变体中接种TuMV原始株和进化株。突变位点主要参与常染色质转座子的调控，突变体对TuMV的抗性高于野生型，尤其是祖先分离株（图4A）。在这些突变体中，ago4和rdr2抗性最强，rdr2抗性最弱。ddm1突变体也产生对原始毒株的强抗性，它缺乏一个转座子的主要调节因子（图4B）。对于组蛋白修饰突变体，ibm1突变体对于进化毒株更敏感，而原始毒株无差异（图4C），IBM1是一种组蛋白去甲基化酶，它从基因组中去除转座子H3K9标记，增强常染色质边界。JMJ14突变体可增强植株对原始/进化病毒的抵抗力，JMJ14也是一种组蛋白去甲基化酶，与基因激活功能相关。因此，表观遗传因子可能是植物中病毒防御机制所必需的。
4 TuMV适应度影响病毒诱导的植株甲基化变化
本研究对祖先和进化病毒感染的植株在2、5、12d进行表观基因组测序WGBS-seq，DNA来自转录组分析的相同样本。根据胞嘧啶甲基化情况，分析差异甲基化区域（DMR），对比分析甲基化的增强或损失。随感染时期，祖先和进化毒株的差异甲基化区域数量相近，而感染末期进化病毒感染植株的CHG甲基化是原始病毒的2倍。CpG甲基化的差异甲基化区域较多，CHG和CHH甲基化差异则在感染末期才增加。大多数CpG差异甲基化区域存在于蛋白编码基因，也包括靠近转录起始位点（TSS）和转座子（TE）（图5A-B）。CHG和CHH差异甲基化区域主要在转座子区域，且在感染后期数量增加。因此，甲基化表达谱表明在TuMV感染期间，转座子区域和编码基因区域都存在差异甲基化，它们之间可能存在相互调节。
图5.感染TuMV的拟南芥野生型表观基因组测序。三种胞嘧啶类型（CpG、CHG、CHH）在转录起始位点（TSS）附近、基因内（GbM）或转座子（TE）内的差异甲基化区域（DMR）数量。A：感染祖先TuMV的植株；B：感染进化TuMV的植株。
5 病毒诱导甲基化对转录组的影响
由于启动子甲基化通常与基因表达变化有关，因此本研究评估靠近转录起始位点的差异甲基化区域对蛋白编码基因表达的影响。如果TSS甲基化在基因表达调控中发挥作用，则两者之间可能存在负相关。结果显示TSS近端甲基化与相关基因表达存在负相关，尤其是感染末期的CpG甲基化（图6A）。这些基因富集于RNA代谢/加工、蛋白质代谢（修饰和易位），与氨基酸、碳水化合物、辅酶、脂类、核苷酸、次级代谢相关的基因也被富集（图6B）。同时，CHG、CHH甲基化发生于转座子区域，也影响邻近基因的表达。在感染早期，大多数甲基调控的转座子距离差异表达基因超过10kb，说明它们的调控不影响附近基因的表达（图6C），而在感染晚期可观察到大量接近差异表达基因的调控转座子，约80个免疫相关基因与转座子邻近。
图6.TuMV诱导的差异甲基化及邻近基因差异表达的相关性。A：转录起始位点附近的差异甲基化区域，这些基因在转录水平上受到调控；B：转录起始位点附近的甲基化与表达负相关的基因的功能特征；C：靠近或远离差异表达基因位点的转座子内差异甲基化区域百分比。
讨论
病毒适应度用于定量描述病毒在特定宿主中的繁殖能力和进化潜力。先前研究表明拟南芥转录组受病毒适应度影响，并确定了促使病毒适应的潜在宿主驱动因子。本研究在此基础上拓展探究宿主DNA和组蛋白表观遗传修饰，结果表明不同适应度的TuMV对拟南芥的甲基化模式和表观遗传调控基因产生不同程度的影响。
本研究评估了表观遗传因素在触发植物应激反应中的作用。表观遗传缺陷突变体表明RdDM因子、染色质重塑蛋白DDM1、组蛋白修饰蛋白IBM1、JMJ14可以控制植株对TuMV感染的应答。其他研究表明DNA甲基化因子的缺失与营养型病原体抗性增加有关，但对坏死型病原体的敏感性增加。研究表明植物组织间的甲基化差异高于胁迫条件下的甲基化差异，使用不同细胞类型和不同病毒浓度，可能对差异表达的准确识别造成影响。本研究观察到TuMV诱导的甲基化及邻近基因表达的负相关，其中RNA或蛋白质代谢相关基因最常见，而生物胁迫相关基因较少。
除表观遗传因素和RNA沉默应答外，转录组数据表明，TuMV诱导其他几种防御机制，包括光合作用关闭、代谢重组、植物免疫通路相关的基因等，其中SA触发的防御反应发挥重要作用。然而，一些SA拮抗基因在不同感染阶段出现高表达，如WRKY25/26/33/38/62，且在进化TuMV感染中，抗SA基因表达更高。虽然两种分离株仅检测出2个SNP，但进化株的毒力明显较高。将转录组和表观基因组数据整合到宿主-病毒互作网络中，将有助于探究病毒适应性的分子机制。
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