科研 | JCI INSIGHT：用scRNA-Seq技术鉴定人源化小鼠HIV-1感染过程中表达TRAIL的先天免疫细胞
编译：Champion，编辑：景行、江舜尧。
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HIV-1感染过程中CD4+T细胞的耗竭主要是由炎症细胞间接介导的，但机制尚未明确。本研究使用单细胞测序（scRNA-Seq）技术研究了HIV诱导的淋巴器官固有免疫细胞的转录变化。从移植人CD34+造血干细胞的NOD/RAG2-/-γc-/-（NRG）小鼠脾脏中分离出hCD45+hCD3-hCD19-白细胞，鉴定了天然免疫细胞的主要群体。HIV-1感染显著上调了涉及I型干扰素炎症通路的基因在每个先天免疫亚群中的表达。研究发现TRAIL在先天免疫群体中上调。阻断NRG-Hu HSC小鼠中的TRAIL信号通路可以在体内防止HIV-1诱导的CD4+T细胞耗尽。综上所述，在单细胞水平上表征了HIV-1诱导的脾脏天然免疫细胞的转录变化，鉴定了TRAIL+天然免疫细胞，并明确了TRAIL信号通路在HIV-1诱导的体内CD4+T细胞耗竭中的重要作用。
论文ID
原名：Identification of pathogenic TRAIL-expressing innate immune cells during HIV-1 infection in humanized mice by scRNA-Seq
译名：用scRNA-Seq技术鉴定人源化小鼠HIV-1感染过程中表达TRAIL的先天免疫细胞
期刊：JCI Insight
IF：6.205
发表时间：2020年6月
通讯作者：Lishan Su
通讯作者单位：美国北卡罗来纳大学
DOI号：10.1172/jci.insight.135344
实验设计
结果
为了全面、公正地研究人类先天免疫细胞及其在人源化小鼠体内发育的转录谱，研究人员对从NRG-Hu HSC小鼠脾脏分离的人CD45+CD3-CD19-细胞进行了scRNA-Seq分析。研究人员从2只小鼠身上获得了6023个人类先天免疫细胞的单细胞转录本，并进行了聚类分析，以检查细胞特征和异质性。并分析了每个单个簇与所有其他细胞之间的基因表达差异，以确定簇标记基因。另使用t分布随机邻近嵌入（t-SNE）细胞可视化方法显示了10个主要簇（图1A），基于PDCs（例如，富集CLEC4C、TCF4）、MDCS（CD1C、SPI1）、巨噬细胞（CD68、CD14）、NK细胞（NKG7、PRF1）、ILC（IL7R）、IDO+髓样细胞（IDO1）、肥大细胞（TPSAB1、CTSG）、CD34+祖细胞（CD34）、B细胞（CD79A、CD19、CTSG）、IDO+髓样细胞（IDO1）、肥大细胞（TPSAB1、CTSG）、CD34+祖细胞（CD34）、B细胞（CD79A、CD19、CD14）、IL7R、IDO+髓样细胞（IDO1）、肥大细胞（TPSAB1、CTSG），和红系细胞（其可能没有被红细胞裂解程序完全裂解）的标记基因表达，（图1B，1C）。结果表明，在NRG-Hu HSC小鼠中形成了主要的人类先天免疫亚群，这与它们对病原体相关分子模式的反应一致，这与人类白细胞的反应相似。
图1. 人CD45+CD3-CD19-免疫细胞在NRG-Hu HSC小鼠脾中的scRNA-Seq分析。（A）基于6023个单细胞转录本，对NRG-Hu HSC小鼠的hCD45+hCD3-hCD19-脾细胞簇进行T-SNE分析。括号中显示了浆细胞样树突状细胞（PDC）、髓系树突状细胞（MDC）、巨噬细胞、NK细胞（NK细胞）、固有淋巴样细胞（ILC）、IDO+髓系细胞、肥大细胞、CD34+祖细胞、B细胞和红系细胞的细胞计数。（B）显示每个细胞类型簇的代表性标记基因表达的小提琴曲线图。（C）标记基因在每个细胞类型簇的单个细胞中的表达热图。
2 HIV-1感染显著改变了小鼠脾脏的人先天免疫细胞的转录图谱
研究人员通过在单细胞水平上检测先天免疫细胞的转录组，确定了HIV-1感染是如何改变先天免疫细胞的。研究人员对HIV-1感染3周后NRG-Hu HSC小鼠脾脏分离的人CD45+CD3-CD19-细胞进行scRNA-Seq。从2只HIV-1感染的小鼠共获得了5607个人类单细胞转录本，然后将它们与来自2个模拟对照小鼠的6023个细胞进行了比较。通过对模拟小鼠和HIV-1感染小鼠细胞的t-SNE分析，研究人员检测到来自模拟小鼠和HIV-1感染小鼠的全部10个人类先天免疫细胞簇（图2A）。HIV-1感染改变了人固有免疫细胞的转录组，包括PDC（128个上调基因和35个下调基因）、MDC（116个上调基因和80个下调基因）、巨噬细胞（24个上调基因和9个下调基因）、NK细胞（71个上调基因和76个下调基因），以及ILC群体（116个上调基因和59个下调基因）。通过基因GO富集图谱分析，发现天然免疫亚群中大多数上调的基因与I型IFN信号通路、对病毒的应答和病毒复制的负调控有关（图2C）。通过对HIV-1感染差异调节基因的Venn图分析，发现在所有天然免疫细胞亚群中都有15个基因上调，并且这15个基因都是干扰素刺激的基因（图2D）。这些结果表明，HIV-1感染在每个先天免疫细胞亚群中触发了IFN-I信号。有趣的是，HIV-1感染在每个亚群中下调的途径都与细胞代谢过程有关，这表明HIV-1感染改变了体内人类先天免疫细胞的新陈代谢。
图2. 通过scRNA-Seq分析NRG-hu HSC小鼠脾脏中的人体细胞。（A）用来自同一供体的CD34+细胞重建的2只模拟和2只HIV-1感染NRG-hu HSC小鼠脾脏的hCD45+hCD3-hCD19-先天性免疫簇的t-SNE分析。不同的颜色表示左侧不同的细胞类型。蓝点表示来自模拟小鼠的细胞，而红点表示来自右侧HIV-1感染小鼠的细胞。（B）对于每种细胞类型，与模拟对照小鼠相比，HIV-1感染的NRG-hu HSC小鼠中上调和下调基因的分布。（C）pDC、mDC、巨噬细胞、NK细胞和ILCs中HIV-1上调通路的GO富集分析。（D）韦恩图显示5个先天性免疫亚群中HIV-1上调的基因重叠。
3 HIV-1感染可诱导所有主要天然免疫亚群TRAIL的表达
艾滋病发病的标志是CD4+T细胞逐渐耗尽。然而，HIV-1感染导致体内CD4+T细胞耗尽的机制尚不清楚。因此，研究人员分析了HIV-1感染诱导的先天免疫细胞的变化是否以及如何导致CD4+T细胞耗尽。他们发现编码TRAIL的TNF超家族成员10（TNFSF10）基因在pDC、MDCS、巨噬细胞和NK细胞以及ILC细胞中被HIV-1显著诱导（图3A，3B）。TRAIL在每个主要的先天免疫亚群中都是前25个差异表达的基因之一。TRAIL+pDC的百分比从模拟小鼠的3.5%增加到HIV-1感染小鼠的37%（图3B）。HIV-1感染还导致MDCS（从21%到66%）、巨噬细胞（从32%到81%）、NK细胞（从14%到38%）和ILC（从28%到56%）的TRAIL表达增加2到3倍（图3B）。利用流式细胞术，研究人员证实了HIV-1感染后PDCs、MDCs、巨噬细胞、NK细胞和ILC中TRAIL蛋白的表达上调（图3C）。
接下来，确定在HIV-1感染的小鼠脾脏中，表达TRAIL的先天免疫细胞是否与TRAIL细胞相比具有独特的转录组。TRAIL+细胞和TRAIL-细胞的差异基因表达分析显示，TRAIL+细胞在pDC、MDCS和NK细胞中表达更高水平的IFN刺激基因，如IFIT3、ISG15和其他IFN刺激基因（图3D和补充表3）。TRAIL+细胞上调基因的字符串网络分析显示，IFN-I信号通路在表达TRAIL的pDC、MDCS和NK细胞中优先激活（图3E），而TRAIL+和TRAIL-巨噬细胞以及TRAIL+和TRAIL-ILC之间的基因转录没有明显变化。
图3. HIV-1感染诱导所有先天性免疫细胞亚群表达TRAIL。（A）通过t-SNE可视化检测模拟和HIV-1感染小鼠的人先天性免疫细胞中TRAIL的表达。（B）标准化唯一分子标识符（UMI）的小提琴图显示TRAIL（TNFSF10）基因表达在模拟或HIV-1感染小鼠不同先天性免疫细胞中的分布。（C）HIV-1感染后5周，通过流式细胞术检测模拟和HIV-1感染小鼠脾脏中每个先天性免疫细胞亚群的TRAIL蛋白表达。（D）Heatmaps显示TRAIL+和TRAIL–细胞在HIV-1感染小鼠的pDC、mDC和NK细胞中的差异表达基因。（E）HIV-1感染小鼠TRAIL+细胞中pDC、mDC和NK细胞类型上调基因的STRING关联网络。
4 阻断TRAIL/DR5信号通路可在体内预防HIV-1感染引起的CD4+T细胞耗竭
在先前的研究中，发现HIV-1感染在体内诱导CD4+T细胞凋亡，caspase-3表达活跃。TRAIL是一种促凋亡配体，具有促进根除感染或恶性细胞的免疫效应功能。以上结果表明，HIV诱导的先天免疫细胞表面TRAIL的表达可能与淋巴器官中CD4+T细胞的耗竭有关。因此，研究人员在体内检测HIV-1感染后CD4+T细胞上是否诱导了TRAIL的死亡受体，发现HIV1感染上调了人源化小鼠脾脏CD4+T细胞TRAIL受体死亡受体5（DR5）的表达，但不上调死亡受体4（DR4）的表达（图4A）。为了阻断TRAIL/DR5信号轴，研究人员使用了一种可溶性形式的DR5与人IgG-Fc融合（sDR5-Ig），它可以防止TRAIL诱导的细胞死亡。后用sDR5-Ig治疗HIV-1感染的NRG-Hu HSC小鼠，从感染后第5天到第35天，每周两次，并分析治疗是否影响HIV-1的复制和防止体内CD4+T细胞的耗尽。虽然sDR5-Ig治疗不影响HIV-1在体内的复制（图4B），但它有效地防止了HIV引起的外周血和脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞的耗尽（图4C，4D）。
此外，研究人员检测到HIV-1感染后CD4+T细胞中活性caspase-3的表达升高，caspase-3是凋亡的替代标志物。发现sDR5-Ig显著降低了HIV诱导的脾脏CD4+T细胞中caspase-3的活化，表明阻断TRAIL/DR5信号通路可以阻止CD4+T细胞凋亡（图4E）。然而，sDR5-Ig治疗并没有挽救因HIV-1感染而受损的T细胞的功能。综上所述，在单细胞水平上证实TRAIL在多个人类先天免疫亚群中上调，并证明TRAIL信号通路的激活与体内HIV-1感染过程中CD4+T细胞的耗竭有关。
图4. 体内阻断TRAIL信号可阻止HIV-1诱导的CD4+T细胞耗竭。（A）代表性流式图和分析数据显示HIV-1感染后3-5周模拟和HIV-1感染小鼠CD4+T（CD3+CD8-）细胞上DR5的表达。（B—E）感染HIV-1的NRG-hu HSC小鼠于感染后5～35d给予sDR5-Ig或对照Ig治疗，每周2次（200μg/只，腹腔注射）。（B）显示HIV-1感染后指定时间点的血浆HIV-1 RNA水平。（C和D）总结处死时（第35天）外周血（C）和脾脏（D）中CD4+T细胞（CD3+CD8-）的数量。（E）代表性流式图和分析数据显示了表达活性caspase-3的脾脏CD4+T细胞（CD3+CD8-）的百分比。
结论
本研究利用单细胞水平上的scRNA-Seq技术，研究了HIV-1感染对NRG-Hu HSC小鼠淋巴器官中人先天免疫细胞转录组的影响。结果显示，HIV-1感染显著改变了每个先天免疫细胞亚群的转录组。TRAIL在先天免疫人群中显著上调，阻断TRAIL信号通路可以防止体内HIV-1诱导的CD4+T细胞耗尽。HIV-1在人源化小鼠体内的感染为研究HIV-1疾病或AIDS的体内发病机制提供了一个有价值的平台。
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