科研 |P NATL ACAD SCI USA：放射对肾癌患者T细胞库的动态影响
编译：小北，编辑：景行、江舜尧。
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结合放疗和免疫治疗的临床研究表现出具有前景的反应率，并且增强肿瘤对免疫介导攻击的敏感性。因此越来越多临床治疗使用预处理方案和免疫疗法。然而，切除的肿瘤很少用放射疗法进行原位治疗，很少有研究调查单独放疗对患者局部或者系统抗肿瘤免疫性的影响。没有这项评估，转化医学的研究将受限于对循环的免疫亚群的评估以及对外周T细胞受体库的系统重塑。这一局限性使得放疗如何影响肿瘤内应答以及驻留在肿瘤上的T细胞克隆是否在治疗后扩增是一片空白。因此，为了探究放疗对肿瘤微环境的免疫效应以及验证放疗起始驻留在肿瘤的克隆局部和系统扩增，研究者分析了接受立体定向身体放射治疗患者的肾细胞癌。通过整体的RNA-seq比较了转录组。T细胞受体测序检测了治疗过程中的细胞库。信号通路分析发现免疫相关的过程在放疗中特异的富集，并且T细胞受体测序也发现放疗处理的肿瘤克隆增多。在一系列血液样本中检测了肿瘤富集克隆型的频率。研究者观察到肿瘤富集的克隆表型在放疗2wk时丰度高于治疗前的水平。然而，这一扩增并不是持续的，在处理后4 wk时水平收缩至基线水平。总之，这些结果说明在放疗后肿瘤内免疫重排，并且驻留在肿瘤的T细胞扩增有利于联合治疗中合理设计治疗方案。
论文ID
原名：Radiation induces dynamic changes to the T cell repertoire in renal cell carcinoma patients
译名：放射对肾癌患者T细胞库的动态影响
期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
IF：9.412
发表时间：2020年9月
通讯作者：Jason B. Muhitch
通讯作者单位：埃默里大学
DOI号：10.1073/pnas.2001933117
实验设计
结果
为了证实在人类肿瘤进行原位放射治疗的效应，研究者分析了一个完整的临床试验样本(NCT01892930)，原发性肾细胞癌患者行肾切除术4周后进行15 Gy SBRT治疗。SBRT处理以及只进行了肾切除术的RCC肿瘤进行了转录组测序（图1A），对表达的数据进行PCA分析发现通过SBRT治疗的肿瘤转录本沿着PC2分离（图1B-C）。PC2的主要参与者包括免疫细胞标记物PTPRC，能够编码CD45和CD48（图1C）。对PC2的前100个参与基因进行信号通路富集分析发现了一些免疫应答信号通路。对PC1进行相似的分析发现唯一显著富集的信号通路是去泛素化。对照样本的PCA分析并未发现集簇，并且对PC1和PC2参与的基因进行验证也并未发现相关富集的信号通路。
图1 SBRT治疗后RCC的转录特征。（A）RNA-seq结果分析只进行肾切除患者（对照）与SBRT+肾切除处理RCC患者的原发性肿瘤；（B）PCA点图展示RCC肿瘤RNA-seq测序结果；（C）热图分析显示前100个基因参与PC2，在患者样本中标准化表达的基因聚类沿着PC2轨迹。
对23,946个鉴定的转录本进行评估发现在SBRT治疗的RCC中有1,471个因的表达上调，而2,547个转录本的表达下调（图2A）。其中SBRT显著增加的基因是IL16，能够编码T细胞化学引诱剂（图2A）。尽管P值校正后显著性不足（图2A），SBRT治疗的样本中肿瘤抗原基因CTAG1A的表达是特异的，与研究者之前通过流式细胞术证实放疗加强后NY-ESO-1蛋白水平升高是一致的。
对只进行肾切除术RCC中差异表达的基因进行基因组富集分析（GSEA），结果发现多个细胞外基质信号通路显著富集（图2B），与之前说明放疗后组织中细胞外基质基因表达降低一致。研究者证实在SBRT治疗的RCC中免疫相关信号通路显著富集（图2B）。特别有趣的是，在SBRT GSEA组中有多个信号通路参与淋巴细胞的活性（图2B-D）。这些信号通路中最显著的是淋巴细胞和非淋巴细胞之间的免疫调节作用，包括编码T细胞表面标记物基因CD3D, CD3E, CD3G, CD8A, 以及CD8B的表达（图2C）。同样在SBRT治疗肿瘤中检测到CD4的表达升高。近期的研究发现经SBRT和ICB治疗的患者，在辐射损伤间IFN-γ-相关的基因的表达与区域外未受到辐射的实体瘤间存在相关性。研究者发现在SBRT治疗的RCC中有3/4的基因表达升高(LCK, TLR8, GPR171)，同时IFNG和IFN-γ信号通路中的成分表达也升高（图2B-D）。之前的报道证实放疗后的产物CXCL10对于CXCR3+ T细胞的招募非常重要。与此一致的是，研究者的实验证实在SBRT治疗的肿瘤中IFN诱导的趋化因子CXCL9,CXCL10, CXCL11，以及对应的趋化因子受体CXCR3的表达升高。其他富集的淋巴细胞相关的信号通路包括CD3的磷酸化以及TCR信号通路（图2B-D）。总之，这些转录组分析结果提示SBRT治疗的RCC中免疫原性升高，包括表示T细胞活性的富集基因和信号通路。
图2 放疗后RCC基因表达与免疫信号通路变化相关。（A） 火山图展示SBRT vs对照组基因差异表达，显著性阈值为|log2(fold change)| >1且Padj < 0.05；（B） GSEA分析对照组以及SBRT组中DE基因，图示展示了前23个高度显著的基因；（C） 淋巴细胞和非淋巴细胞免疫相互作用的雷达图。线表示单个患者的值表明DE基因；（D） TCR信号和IFNG信号通路中DE基因的热图分析。
2 TCR测序揭示SBRT治疗RCC中克隆性增加
透明细胞RCC是最严重的免疫渗透实体瘤之一，伴随有T细胞而不是巨噬细胞，是主要的免疫细胞亚群。肿瘤患者中T细胞库的构成一直是研究的热点。基于转录组学数据，SBRT治疗的RCC表现出广泛的免疫活化（图2），研究者猜想RCC肿瘤内T细胞克隆性可能被放疗改变，并且在肿瘤微环境中的T细胞克隆系统扩增。为了检测这一假说，研究者在RCC患者肿瘤以及外周血中进行了TCRβ测序。利用高通量技术分析了53个样本，包括26个肿瘤和27个外周血样本，并且证实了4,016,671个特异的CDR3核苷酸序列突变体，能够编码2,658,974 个特异的CDR3氨基酸序列。在患者肿瘤中探究个体氨基酸序列间重叠的部分发现，无论是否接受治疗大多数序列在特定个体中特异。SBRT治疗的RCC具有较高的克隆性（图3A）。
这一现象进一步通过累积频率对前10,000个克隆亚型进行分析证实，说明丰度最大、数量较小的克隆亚型代表整体T细胞库的比例越大（图3B）。平均而言，前100个丰度最大的克隆亚型代表肾切除术中43%的T细胞库，以及SBRT治疗RCC中54%的T细胞库（图3B）。幂回归模型证实SBRT样本中的平均功率系数低于对照组（图3C），这与SBRT样本更接近高克隆性模型一致。
图3 肾切除且SBRT治疗的RCC肿瘤内T细胞库分析。(A) 箱线图展示了在对照和SBRT患者肿瘤中T细胞库的克隆型，通过immunoSEQ分析仪获取每个患者的值，点表示每个个体值，菱形表示平均数；(B) 对照组和SBRT组的累积频率分布，黑色虚线表示SBRT和对照肿瘤T细胞库前100的平均累积频率，饼图表示指定患者中前100个克隆型的代表性累计频率；(C) 患者非线性回归幂系数的箱线图，*P <0.05。
SBRT治疗的肿瘤中克隆性增加使得研究者猜想具有相似氨基酸序列的TCRs是否对T细胞库的改变有影响。尽管之前临床前研究发现对小鼠肿瘤放疗将导致更长CDR3氨基酸长度频率增加，研究者并未在人类样本中观察到。研究者检测了数组带有编码不同氨基酸序列的不同核苷酸序列病人间克隆亚型，结果发现随着氨基酸结合频率的增加，每个氨基酸序列汇总过剩的克隆亚型数量也增加（图4A）。线性回归分析说明在SBRT治疗的RCC中这种现象更加广泛（图4B）。
之前有报道称肿瘤放疗能够提高肿瘤抗原的表达，可能会导致相似的克隆亚型，但不一定对这些抗原反应具有相同特异性。为了探究放疗的RCC患者中具有相似TCR特异性的淋巴细胞频率是否升高，研究者对肿瘤内细胞库进行了主要的基序分析。CDR3氨基酸序列组符合同源阈值，并且将图谱1%限定为主要的基序，用树状图代表主要的基序，并用氨基酸序列的同源性确定分支的长度（图4C）。SBRT治疗的肿瘤包含更多主要的基序（图4D）。当对样本中积累的基序进行评估时发现SBRT治疗的样本中细胞库的比例更大（图4D-E）。总之，研究者对T细胞库的评估发现在SBRT治疗的RCC通过更高的克隆性，以及主要基序数量和频率的增加进行细胞库重塑。
图4 SBRT影响具有相似特异性克隆亚型占据的TCR库的累积频率。(A) 对RCC肿瘤中剩余模板的评估；(B) 患者线性回归斜率系数的箱线图；(C) 对瘤内TCR序列进行免疫印迹(ImmunoMap)鉴定同源序列集簇；(D) 个体肿瘤中显性基序数量以及显性基序累积频率的箱线图；(E) 堆叠条形图展示显性基序的数量以及T细胞库中的比例，点代表个体患者值，菱形表示平均值。
3 SBRT处理后在外周血中对肿瘤富克隆亚型进行追踪
为了探究患者T细胞群体的时空差异，研究者对SBRT治疗患者的外周血样本进行了分析。对于每位患者，研究者只考虑在至少一个病人样本中前10000个T细胞克隆亚型。与乳腺癌和黑色素瘤患者样本中的评估一致，研究者在特定患者肿瘤和外周血中观察到了大量共有的克隆型。在肿瘤中42 ± 9%的克隆型同样在外周血基线水平检测到（图5A）。每个患者细胞库的比例被确定为肿瘤富集的克隆型(TECs)以及处理前血液中富集的克隆型(BECs) (|log2(ratio)| ≥5)（图5A），包括在基线血液样本中没有观察到的新的肿瘤克隆亚型（图5A）。因为病人基线血液和肿瘤样本来自不同组织以及不同的采集时间点（图1A、5A-B），最初观察到的现象使得研究者猜想在病人血液中TECs在何时开始升高，以及在治疗过程中重塑T细胞库。
为了探究放疗后患者T细胞库的动态变化，研究者将分析扩展到了纵向外周血样本。近期高影响因子的报道证实克隆的T细胞扩增以及外周血中收缩可作为应答放疗和ICB的指示物。对患者血液基线以及第2周前10个肿瘤克隆亚型进行比较，结果发现在该时间间隔频率升高（图5C），前10个基线克隆的频率降低。研究者也发现在治疗后2周和4周之间前10个肿瘤克隆频率显著降低（图5C）。对每个患者所有血液样本前10个肿瘤克隆的平均差异倍数进行分析，发现在基线和2周之间是正向差异倍数，而在2周和4周之间是负向差异倍数，与那些高丰度肿瘤克隆在外周血中的频率阶段性升高并且随后降低一致（图5D）。相反，当评估基线到4周的改变时没有检测到显著差异（图5C），说明对细胞库动态性评估时样本收集的时间非常重要。
这一结果使研究者分析了一段时间内患者肿瘤和血液样本中细胞库相似性的动态变化。对病人肿瘤和一系列外周血样本进行gross比较发现在2周时重叠最大(48% ± 10%)。在基线和第2周之间隔层富集的克隆亚型扩增进行差异丰度分析，发现主要是TECs，而在2周和4周之间收缩的克隆亚型特征发现更多的是TECs (22%)，而不是BECs(1%)。此外，在治疗后的血液样本中对TECs进行追踪发现，尽管最后一次抽血和肾切除都发生在第4周，大部分循环中的TECs首次在第2周检测到（图5E-F）。而平均25%的TECs是2周检测到，只有16%在第4周检测到，此外大部分第4周检测到的TECs之前在第2周出现（图5E-F）。总之，这些结果提示驻留在肿瘤上的克隆扩增发生在SBRT的第2周，但是肿瘤相关T细胞扩增是短暂的，在治疗后第4周频率降低。
图5 T细胞克隆型频率的外周变化。(A和B)展示了样本间克隆分布的散点图；（A） 基底外周血vs肿瘤，颜色代表相对频率：肿瘤(橙色)、基底外周血(紫色)，样本丰富的克隆型为正方形，左侧垂直线代表新的肿瘤克隆型；（B） 纵向外周血样本之间的比较。上面的三角形表示扩展，下面的三角形表示收缩，颜色表示样品的丰富；（C） 外周血样本中前10个显著克隆型的频率。黑线表示每个患者中代表性的克隆。（D） 图C中展示每个患者克隆数的平均倍数变化，方块和黑线代表平均值；（E） 代表性Sankey点图展示了外周血样本中TECs的检测（F） 折线图展示了放射后患者血液中检测到的TECs百分比线图，方块和黑线代表平均值；（G） Baroni-Urbani以及Buser系数表示患者血液样本与肿瘤的相似程度，方块和黑线代表平均值。
结论
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