科研 | Nature Medicine：口服大环内酯类抗生素通过改变肠道微生物组成降低不发达国家儿童死亡率

编译：白羽，编辑：十九、江舜尧。

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导读

在尼日尔，马拉维和坦桑尼亚进行的“口服大环内酯类抗生素逆转死亡率以及耐药性监测计划”（Macrolides Oraux pour Réduire les Décès avec un Oeil sur la Résistance, MORDOR I）试验表明，向学龄前儿童分发阿奇霉素可降低儿童死亡率。然而，这项计划虽然受众面庞大但是试验设计简单，降低儿童死亡率的具体机制无法被断定。因此，我们检测了来自30个尼日尔社区的学龄前儿童的肠道微生物组，他们被随机分配为一年两次口服阿奇霉素或安慰剂。两组儿童肠道微生物组γ-多样性没有显着改变（P = 0.08），但在24个月的随访中发现，口服阿奇霉素的儿童肠道内两种弯曲菌属相对丰度增高，另有33种肠道细菌的相对丰度显著降低。宏基因组分析揭示了治疗组之间肠道细菌的功能差异。耐药基因组分析显示，口服阿奇霉素的粪便样本中大环内酯类抗性基因表达增加（P = 0.004）。这些结果表明，延长大规模分发阿奇霉素的时间通过减少某些有害肠道细菌降低不发达国家儿童死亡率，但同时也会造成一定程度的抗生素耐药性。

论文ID

原名：Gut microbiome alteration in MORDOR I: a community-randomized trial of mass azithromycin distribution

译名：MORDOR I计划中肠道微生物组的改变：大规模分发阿奇霉素的随机社区试验

期刊：Nature Medicine

IF：30.641

发表时间：2019年8月

通信作者：Thuy Doan

通信作者单位：加州大学旧金山分校

实验结果

MORDOR 一期试验是一项大规模、双盲和安慰剂对照的人群随机试验，于2014年至2017年间在三个国家进行：尼日尔、马拉维和坦桑尼亚。尼日尔的试验结果显示，与接受一年两次安慰剂治疗的人群相比，接受半年一次口服阿奇霉素药物治疗（MDA）的学龄前儿童（1-59个月）的死亡率降幅最高。虽然阿奇霉素对感染性病原体的杀伤作用被推测为主要的原因之一，但尸检报告并未揭示降低全因死亡率的机制。人类最大的病原体库存在于肠道中，推测阿奇霉素导致肠道病原体负荷的改变，因此，作者对来自尼日尔随即分为安慰剂组和给药组的30个村庄的学龄前儿童（n = 600）的直肠样本进行了宏基因组DNA测序。

图1 | 研究设计。说明研究方案的流程图

预设的结果是阿奇霉素导致基于由置换多元方差分析（PERMANOVA）确定的欧氏距离决定的肠道微生物组成结构的改变。第24个月时，在村落为单位的数据级上，MDA组肠道微生物组没有发生重大的全局变化（P = 0.48，图2a）。然而，相对于安慰剂组（13.1,95％置信区间(CI)：8.4-17.6），MDA组（10.9,95％(CI)：4.9-15.5）γ-多样性或肠道微生物组的丰富程度降低，虽然这一结果没有统计学意义。在微观分析下，在第24个月时，参与单独测序的MDA组个体肠道微生物种属水平与安慰剂组在35种细菌的相对丰度上存在有显著差异（P＜0.01, log₂(fold change)＞2.0，图S1，表S2,S3）。其中弯曲菌（Campylobacter upaliensis）在MDA组肠道中显着减少，这种菌能引起儿童腹泻。由于弯曲菌属（Campylobacter）是一类研究比较透彻的病原菌，因此作者选用弯曲菌属作为疾病预防和治疗的代表。我们通过MetaPhlAn2进行同一组非宿主测序读段以进行分类学比对，然后使用线性判别分析效应工具（LEfSe）确定丰度差异（图3b，c）来检验灵敏度，结果安慰剂治疗的儿童的肠道中C. upsaliensis的丰度再次提升（图3c）。由于弯曲菌可能存在地理差异性，因此我们分析了在基线时随机位置的村庄是否存在C. upsaliensis的全局空间相关性（图3d），最终证明基线时C. upaliensis的丰度与地理位置无关（Moran's I P = 0.86），两组之间的C. upsaliensis丰度没有差异（P = 0.22）。

图2 肠道微生物群落，多样性和组成，学龄前儿童随机分为安慰剂和阿奇霉素治疗组。

图3 服用安慰剂与阿奇霉素治疗的儿童个体、微生物属和物种的相对丰度不同。

接下来深入探究了阿奇霉素分发如何影响肠道细菌功能特征。能够匹配到的物种特异性基因被赋值到UniRef，基于这些注释，使用MetaCyc数据库和HUMAnN2流程将每个样品的宏基因组映射到代谢通路中，最终发现安慰剂组的儿童的肠道微生物组包含更多对细菌生长有利的代谢途径，如嘌呤从头合成和肽聚糖合成（图4a，b）。此外，在安慰剂组儿童的肠道微生物群中，和免疫调控、炎症相关的重要代谢通路过度活跃（糖酵解，磷酸戊糖途径，氨基酸代谢和脂肪酸生物合成）（图4b和表S4, 5） 。这些结果表明，未受干预的尼日尔儿童的肠道微生物组学特征主要体现为微生物生存，生长和炎症反应。

图4 治疗组间细菌功能谱及耐药性。

大规模抗生素分发带来的主要公共卫生问题是选择性耐药。在之前的研究中，作者使用宏基因组DNA测序发现抗生素能引起肠道中大环内酯类抗性基因决定因子增加，然而，DNA水平上抗性基因决定簇的增多不总能在表型上引起耐药性的增强。因此，评估了300名儿童粪便样本中抗性基因的RNA水平。在阿奇霉素第四次治疗后6个月，与安慰剂相比，大环内酯类抗性基因表达率增加（P = 0.004;图4c），而且，大规模阿奇霉素分发没有导致其他类型抗生素抗性的显著改变（图4d，图S2和表S6）。但是，不排除给药后数天内抗生素耐药性发生短暂性或者长久性改变。MDA组儿童肠道中大环内酯类抗性基因表达的阳性率在24个月时为16.7％（95％CI：9.3-24.7）；在MDA组的同一村庄的儿童鼻咽中分离的肺炎球菌中大环内酯类耐药菌株的检测率为12.3％（95％CI：5.7-20）。因此，鼻咽和肠可能都是阿奇霉素相关抗性监测的有用位点。阿奇霉素是一种广谱的氮杂内酯类抗生素，半衰期长，具有很强的组织渗透性; 它主要用于治疗眼部，呼吸道和肠道感染。此外，阿奇霉素是治疗弯曲菌感染的药物。在世界上，弯曲菌属是急性胃肠炎最常见的原因。在撒哈拉以南非洲国家，腹泻病占5岁以下儿童死亡病因的25％，其中弯曲菌是儿童腹泻中最常见的病原体，弯曲菌感染还能导致儿童生长缺陷，营养不良，肠道炎症，自身免疫性疾病和神经系统后遗症。虽然空肠弯曲菌Campylobacter jejuni和结肠弯曲菌Campylobacter coli最常与肠胃炎相关，但作者并未检测到这些物种在治疗组之间存在丰度差异，这个结果与最近的研究发现一致，即空肠弯曲菌Campylobacter jejuni与马里和冈比亚婴幼儿的肠胃炎发生无关。相反，在阿奇霉素治疗后，C.upaliensis被发现显著减少。与空肠弯曲杆菌和大肠杆菌相似， C. upsaliensis可引起胃肠炎，导致出血性腹泻和菌血症，尤其是营养不良或免疫功能低下的儿童。弯曲菌的常规培养通常不检测C. upsaliensis，一些较新颖的商业分子肠容组分析会将其包括在内。

尽管培养物检测存在局限性，但C.upaliensis是美国2010年至2015年通过食源性疾病主动监测网络向疾控中心报告的第三种常见的弯曲菌物种。它在腹泻病中的重要性可能被低估，特别是在尼日尔，很少或根本没有关于弯曲菌感染报告的数据。

大规模阿奇霉素分发对任何给定群体的感染负荷的影响可能是通过该社区中个体致病菌株携带减少的群体效应。在发达国家，大多数弯曲菌被认为通过受污染的水，家禽，家养动物如狗和猫传播，而且很少在人类传播。如果仅能从环境中获得病原体，那么降低人类感染负荷可能不会影响弯曲菌相关疾病的发生。然而，在尼日尔等不发达国家，露天排便，缺乏自来水，卫生条件差和粪口污染是常见的事，所以，可以通过治疗人类宿主来限制疾病流行。事实上，资源匮乏的儿童弯曲菌负荷随着大环内酯抗生素的治疗而减少。在四次每半年服用阿奇霉素治疗后观察到的大环内酯抗性增加表明MDA对降低儿童死亡率的作用可能最终随着时间的推移而下降，这尤其令人担忧。此外，大环内酯类抗性弯曲菌对公众健康构成严重的抗生素耐药性威胁，因为氟喹诺酮类抗性弯曲菌相当普遍。虽然作者发现大环内酯类耐药基因总体上有所增加，但无法检测到治疗组之间24个月时弯曲菌中与大环内酯抗性相关基因表达的显著差异（P = 0.66;图S3）。此外，MORDOR 二期试验中，每两年一次口服阿奇霉素给药延长至第三年，儿童死亡率持续改善，这表明任何抗生素耐药性的增加都没有超过阿奇霉素在儿童死亡率方面的贡献。在第四次MDA后6个月测量的学龄前儿童肠道中的C.upaliensis丰度持续性减少可能无法反映肠道微生物组的即时改变。之前，作者选择了一个同样参与MORDOR 一期试验的尼日尔村庄，以评估阿奇霉素对学龄前儿童肠道微生物组的短期影响。发现阿奇霉素服用后第五天，肠道弯曲菌属丰度就显著降低，这与本研究的结果一致。弯曲菌属，以及本研究中鉴定出的其它33种显著减少的微生物（表S2和S3），可能通过以下一种或多种潜在机制提升尼日尔儿童死亡率。首先，单独减少病原体负荷可以直接减少这些儿童中致命性胃肠炎发作频次。其次，阿奇霉素可能重新矫正肠道代谢功能，减少肠道炎症反应（图4a，b）并增强营养吸收，尽管大规模阿奇霉素分发尚未发现营养指数得到改善。最后，减少肠道炎症可以提高这些尼日尔儿童感染后的恢复能力。MORDOR 二期试验是对尼日尔MORDOR 一期试验的继续研究，作者将持续探索和研究，以确认两年一次服药持续四年能够持久性带来病原体感染减少。这项工作由于受到尼日尔儿童研究人口的限制，结果可能无法推广到其他地理区域或年龄组。此外，本研究的目的不是评估弯曲菌感染对儿童死亡率的原因和影响，尽管大多数儿童在5岁之后才成为无症状携带者，但不能排除这些安慰剂组儿童肠道中较高的弯曲杆菌丰度侧面反映了非病理性的定植过程。

评论

肠道菌落的组成、比例以及结构与健康息息相关，本研究通过肠道宏基因组检测的证明导致阿奇霉素能够通过减少肠道C.upaliensis显著降低儿童死亡率降低，同时对细菌耐药风险进行了评估。 为明确儿童多发性胃肠炎的发病机制、病理生理和治疗提供了完善的思路。

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