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导读
中国发酵蔬菜的制作传统历史悠久，其中以西北地区的浆水和东北地区的酸菜最具代表性。发酵蔬菜的味道和风味等特点高度依赖发酵过程所生长的细菌群落，之前通过纯培养法、变性梯度凝胶电泳以及实时定量PCR等方法研究了浆水、酸菜等发酵蔬菜的菌群构成，为浆水和酸菜的菌群组成提供了丰富的信息，但对于两菜品的菌群总体差异仍缺乏全面的研究。此外，浆水和酸菜的发酵制作地域对于两种菜品的特点也具有一定影响，然而，目前缺乏在大规模地理范围内的采样研究。本研究在西北和东北不同地区分别采取10个浆水和酸菜样本，并使用高通量测序技术鉴定样本的细菌群落组成，系统地比较了这两种发酵蔬菜产品之间细菌群落的差异。本研究旨在加深对浆水和酸菜中微生物群落的认识，并对浆水和酸菜的生产进行指导。
原名：Bacterial community and composition in Jiang-shui and Suan-cai revealed by high-throughput sequencing of 16S rRNA
译名：通过16S rRNA高通量测序，揭示了浆水、酸菜的细菌群落和组成
期刊：International Journal of Food Microbiology
IF：4.006
发表时间：2019
通信作者：熊涛
通信作者单位：南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室；南昌大学 食品科学与技术学院
1. 样本来源及理化性质检测
分别在中国西北甘肃省和陕西省不同地区采集10个浆水样本，在东北辽宁省不同地区采集10个酸菜样本。使用pH计检测样本pH值和可滴定酸度（TA），使用盐度计检测样本盐度，使用HPLC检测蔗糖，葡萄糖，果糖，乳酸和乙酸的浓度。
2. DNA提取，PCR扩增和焦磷酸测序
DNA提取试剂盒：Rapid Bacterial Genomic DNA Isolation Kit (Sangon Biotech, Shanghai, China)。
引物：341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，扩增16S rRNA基因的V3-V4区。
PCR纯化试剂盒：GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific, U.S.)。文库制备及定量试剂盒：TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit (Illumina, USA)；QuantiFluor™-ST (Promega, U.S.)。
3. 数据分析与统计
使用QIIME计算α多样性，基于Unifrac的β多样性分析用于比较所有样本的差异，基于UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）用于比较样本之间的差异，LEfSe分析用于确定浆水和酸菜样本之间微生物组的差异，P值<0.05认为差异显著。
1. 物理化学性质
TA和pH是发酵蔬菜的两个基本特征值，不仅影响细菌群落，还代表发酵蔬菜的质量，例如发酵蔬菜的成熟度或腐败程度。浆水样本和酸菜样本的pH值分别在3.24-4.23和3.49-6.50之间，TA值分别在1.9-8.7 g/L和1.04-13.58 g/L之间，表明大部分研究样本已经成熟。浆水样本中的盐浓度（0.8-3.4 g/L）、乳酸含量（2.49-9.83 g/L）、乙酸含量（0.60-5.06 g/L）和草酸含量（0.03-4.61 g/L）均低于酸菜样本，而蔗糖、葡萄糖和果糖在浆水和酸菜样本中浓度均较低。结果表明，浆水和酸菜样本的pH值和盐度具有显著差异（p <0.05），浆水属于无盐发酵蔬菜，而两种样本的TA值、乳酸、乙酸和草酸含量无显著差异（图1）。
图1. 浆水与酸菜样本理化性质及多样性指数比较。
2. 系统发育组成和α多样性
在研究的20个样本中共获得1704922条reads，平均每个样本85246条。基于97％相似性的OTU稀疏性分析表明，测序深度满足测序和分析的要求（图2A），物种累积曲线表明样本可以进行物种丰度预测（图2B）。表2中ACE和Chao1反映细菌丰度，Shannon指数和Simpson指数反映细菌群落多样性。样本Good's coverage值> 0.99，表明该信息足以反映样本大多数细菌群落信息。t检验还显示，浆水样本中细菌组成的α多样性显著（p <0.05）低于酸菜样本（图1）。
图2. 稀疏曲线和物种累积曲线。
表2. 细菌样本的总读数，α-多样性指数和Good's覆盖率。
3. 细菌群落多样性
16S rRNA基因序列显示，所有样本的微生物群落包括25个门，60个纲，112个目，220个科，440个属和255个种。在门水平（图3.A），厚壁菌门是浆水和酸菜样本中最主要的菌门，浆水中厚壁菌门的相对丰度（均值95.1％）高于酸菜（均值67.5％）。相反，浆水样本中变形菌门的相对丰度（均值2.6％）低于酸菜样本（均值23.0％）。在科水平（图3.B），样本中64.8％至97.6％的细菌属于乳杆菌科、动性球菌科、肠杆菌科、莫拉氏菌科、黄单胞菌科、醋杆菌科、毛螺菌科、微杆菌科、明串珠菌科和根瘤菌科，总体而言，乳杆菌科在所有样本中丰度最高。大多数浆水样本中乳杆菌科（87.4-97.1％）的比例高于酸菜样本（16.7-87.2％）。在属水平（图3.C），大多数样本中乳杆菌的含量最高（14.8-96.5％），其他丰富度较高的菌属包括片球菌（0.4-57.3％）、芽孢八叠球菌（0.02-48.3％）、柠檬酸杆菌（0-44.3％）、 嗜冷芽胞杆菌（0-21.5％）、不动杆菌（0.05-16.03％）等。在种水平，所有样本中的前十类菌种包括发酵乳杆菌、解淀粉乳杆菌、桥乳杆菌、小片球菌、棒状乳杆菌、戊糖乳杆菌、类短乳杆菌、罗旺醋酸杆菌、埃氏慢生根瘤菌和罗伊氏乳杆菌。
4. 浆水与酸菜样本的比较
根据加权的PcoA分析，PC1和PC2轴显示物种的累积百分比方差值为71.51％和15.21％。根据未加权的PcoA分析，PC1和PC2分别占样本微生物的32.95％和15.66％，表明浆水和酸菜样本之间的细菌群落差异显著（图4）。
图4. 基于UniFrac的主坐标分析。（A）未加权。（B）加权。片球菌属、芽孢八叠球菌属、嗜冷芽胞杆菌属、嗜冷杆菌属、盐单胞菌、海洋单胞菌、假交替单胞菌以及魏斯氏菌属等在酸菜样本中丰度更高。乳杆菌属、醋杆菌属、涅斯捷连科氏菌、链球菌属以及明串珠菌属在浆水样本中丰度更高（图5A）。所有样本可以分为浆水和酸菜2类，表明样本组内具有相似的细菌群落结构，而组间群落结构差异显著。（图5B）。
图5. （A）细菌群落热图分析。（B）多样本相似树。LEfSe分析进一步表明，在浆水中发酵乳杆菌、解淀粉乳杆菌、厚壁菌门、芽孢杆菌、乳杆菌目、乳杆菌科、乳杆菌属和德氏乳杆菌丰度更高，而在酸菜中变形菌门、γ-变形菌门、肠杆菌目、肠杆菌科、柠檬酸杆菌属、棒状乳杆菌、戊糖乳杆菌、类短乳杆菌、黄色单胞菌科、寡养单胞菌属、黄色单胞菌目、片球菌属、小片球菌、沙雷氏菌属、根瘤菌目、假单胞菌目、粘质沙雷氏菌和莫拉氏菌科丰度更高（图6）。此外，研究结果表明浆水和酸菜样本菌群结构差异显著的原因主要包括生产过程、酸浓度、原料以及地理因素等。
图6. 浆水和酸菜样本LEfSe分析。（A）微生物群结果柱状图，阈值为4。（B）反映浆水和酸菜微生物群丰度的进化分枝图。
作者使用高通量测序技术鉴定浆水和酸菜样本中的菌群组成，并比较它们的微生物结构和物理化学性质。在所有样本中都鉴定出25个菌门，440个菌属和255个菌种。浆水与酸菜样本的细菌群落组间差异显著，浆水以乳杆菌属为主，而酸菜以乳杆菌属和片球菌属为主。浆水样本中的主要菌种为解淀粉乳杆菌、发酵乳杆菌以及桥乳杆菌，而酸菜样本中的优势菌种为小片球菌、棒状乳杆菌、戊糖乳杆菌和类短乳杆菌。然而，不同菌种的具体作用机制，仍需要进一步研究来证实。
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