科研 | Microbiome：基于宏基因组和宏转录组揭示肉牛品种对瘤胃微生物的影响及其与饲料转化率的关系
编译：Mushroom，编辑：小菌菌、江舜尧。
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微生物在瘤胃消化代谢过程中发挥重要的作用，对牛的饲料转化率有显著影响。然而，肉牛品种对瘤胃微生物群落的影响程度及其与饲料转化率之间的关系尚不清楚。
本研究利用宏基因组学和宏转录组学，对48头三个肉牛品种（安格斯、夏洛来，Kinsella杂交）的饲料转化率（高和低）和瘤胃微生物进行了比较，旨在找出其瘤胃微生物组成、功能潜力和功能活性的差异，并评估肉牛品种和饲料转化率对瘤胃微生物群落的影响。
本研究表明宏转录组学比宏基因组学更适用于研究瘤胃微生物和宿主表型，并且总RNA亚转录组效果优于mRNA富集的亚转录组；宿主品种基因型和瘤胃微生物群之间的交互作用影响肉牛饲料转化率。该研究证明通过选择宿主品种来设计特定瘤胃微生物群是可行的。
论文ID
原名：Comparative metagenomic and metatranscriptomic analyses reveal the breed effect on the rumen microbiome and its associations with feed efficiency in beef cattle
译名：基于宏基因组和宏转录组揭示肉牛品种对瘤胃微生物的影响及其与饲料转化率的关系
期刊：Microbiome
IF：10.350
发表时间：2019.01
通信作者：Le Luo Guan
通信作者单位：加拿大阿尔伯塔大学，农业、食品和营养科学系
实验设计
采取在相同饲养条件下，饲喂相同高能肥育日粮（80%的大麦颗粒、15%的大麦青贮和5%的基兰、30%的牛肉补充剂颗粒）的三个品种（安格斯、夏洛来、Kinsella杂交）的48头（每个品种16头）牛瘤胃内容物，每个品种又分为高饲料转化率牛（L-RFI，n=8）和低饲料转化率牛（H-RFI，n=8）。提取样本DNA分析宏基因组，提取RNA分别分析总RNA（T-）和mRNA富集（M-）宏转录组，而后进行统计学分析。揭示不同研究水平下，不同品种肉牛瘤胃微生物的差异及其与饲料转化率之间的关系。
结果
三个肉牛品种间RFI值差异不显著（P=0.73），但品种内RFI值差异显著（<1.00E−5；表1）。宏基因组（每个样本的平均值：54.63±1.42M），T-宏转录组（64.32±0.74M）和M-宏转录组（55.11±1.90M）测序分别得到2622.07M，3087.41M，2645.13M的数据。经随机抽样检验，本研究所得宏基因组数据对牛瘤胃微生物基因组具有代表性。
表1 实验选用三个肉牛品种的基础数据
NA 不可获得
1用方差分析计算3个品种间的P值，不同上标的P值差异显著。
2H-RFI组和L-RFI组之间的P值采用每个品种内的t检验获得。
1. 在DNA和RNA水平上瘤胃微生物组的功能注释
基于UniProt数据库标注20314,713个contigs（35.21%），分别有62.02±0.56%的宏基因组、33.04±0.54%的T-宏转录组和32.19±1.50%的M-宏转录组序列可以与标记的contigs匹配。
3个样品（ID：101、103和104）的宏基因组和T-宏转录组数据组装后的reads与UniProt数据库比对率明显高于组装前的reads（57.56±1.20% >22.53±0.52%，28.99±0.27% >11.78±2.33%，E= 1E−5作为分界值，P <0.05），而M-宏转录组的两种reads比对率相似（33.18±2.49%≈33.25±2.57%，P=0.94）。这些结果表明以组装的宏基因组contigs作为参照，可以最大限度的提高宏基因组和T-宏转录组数据的功能分类率，而对M-宏转录组数据没有明显作用。
在宏基因组中，对3,589,489个contigs进行eggNOG功能注释，表2显示数据详细信息。从中观察到23个eggNOG功能类别，其中有10.43％，8.15％和8.10％的基因组分别参与“复制，重组和修复”，“氨基酸转运和代谢”和“碳水化合物转运和代谢”。而在宏转录组中，“碳水化合物转运和代谢”是最活跃的功能类别（在T-宏转录组和M-宏转录组中分别为13.96％和13.78％）（图1）。
表2 宏基因组和宏转录组数据概况
图1 宏基因组、T-和M-转录组的eggNOG功能注释。T-转录组和M-转录组分别代表总RNA和mRNA富集的转录组。
2. 宏基因组和宏转录组之间的数据分析
基于eggNOG功能分类的主成分分析显示宏基因组和宏转录组数据之间的功能注释存在显著差异，并且与宏转录组数据相比，宏基因组数据所注释的功能更紧密地聚集在一起（图2a），表明RNA水平的个体间功能变异程度大于DNA水平。
有几种功能类型在DNA水平上丰富，但在RNA水平上表达较低（如“复制，重组和修复”（~2倍，P <0.05），“细胞外结构”（~3倍，P<0.05）和“防御机制”（~3倍，P<0.05））（图1和图2b，c）。RNA水平上高表达的功能性基因包括“碳水化合物运输和代谢”、“翻译、核糖体结构和生物发生”、“细胞运动”和“细胞骨架”是DNA水平的2-6倍（P< 0.05），其中最活跃的功能类别是“碳水化合物运输和代谢”。
尽管宏基因组和宏转录组数据注释所得的功能图谱有差异，但它们之间存在很强的相关性（宏基因组和T-宏转录组之间r=0.91，P=1.88e−6；宏基因组和M-宏转录组之间r=0.92，P=1.69e−6；图2b，c）。线性回归结果表明宏基因组可以解释T-宏转录组（57.57%，P=2.61e−06）和M-宏转录组的数据差异（60.81%，P=6.67e−06）。这些结果表明：宿主表型与瘤胃微生物活性（在RNA水平上）密切相关，因此在RNA水平上的分析可以更好的代表瘤胃微生物组与宿主表型表现之间的关系。
图2 瘤胃宏基因组和宏转录组数据集之间可识别的微生物功能图谱。 a基于eggNOG功能类别的自动标度丰度(cpm)的主成分分析。 b宏基因组和T-宏转录组之间的相关性。 c宏基因组和M-宏转录组之间的相关性。b图和c图中的每个散点表示DNA和RNA水平上每个功能类别的平均丰度值（cpm）的log10转换值。
3. M-宏转录组和T-宏转录组之间的数据分析
表2显示T-宏转录组数据中有93.71±0.16%是rRNA，而M-宏转录组数据中仅有46.66±2.14%是rRNA（t检验，P=7.36e−26），且M-宏转录组中剩余的rRNA被归类为真核生物28S rRNA(34.08±2.29%)，这表明Ribo-Zero试剂盒可以有效的去除rRNA，但它富集mRNA的效率受微生物组成的影响。T-宏转录组的reads与组装后的宏基因组contigs的匹配率（66.85±0.65%）高于M-宏转录组（54.43±1.16%，t检验，P=6.42e−18）。这表明T-宏转录组与宏基因组数据相似性更高，而M-宏转录组可能捕获了更多的低表达基因。并且，M-宏转录组在eggNOG注释到的reads数量多于T-宏转录组。(412，875±30，166 >23，590±1494，P=1.16e−17；t检验)。
主成分分析显示，T-宏转录组和M-宏转录组数据注释得到的总体功能类别没有明显的差异（图3a，b）。同时，基于功能基因（r=1.0，P=3.61e−7）和表达基因(r=0.84，P<2.20e−16)的分析结果显示，T-宏转录组和M-宏转录组数据之间存在强相关性(图3c，d)。基于功能类和表达基因的线性回归分析的R2值分别为1.00(P<2.2e−16)和0.94(P<0.05)。品种内的聚类分析显示，除少数样本外，同一样本的T-宏转录组和M-宏转录组数据处理结果相似(方法间变异<样本间变异)（图3e）。
用DESEQ2分析鉴定出T-宏转录组和M-宏转录组中有10个差异丰富的功能注释(P<0.05)，尽管变化程度较低(从-1.32到1.06，P<0.05)。同时，在T-宏转录组和M-宏转录组之间有2050个基因具有不同的丰度（FDR<0.05），并且大多数基因丰度在M-宏转录组中较低(图3d)。并且，M-宏转录组的RNA测序深度约为T-宏转录组的17.5倍（表2)。结果表明，M-宏转录组可以增加测序深度，提高宏转录组在功能分析上的分辨率，但可能会在基因表达水平的估计上存在偏差。相反，T-宏转录组不止可以产生与M-宏转录组相似的总功能类别估计，也可用于分类学鉴定。
图3 T-宏转录组和M-宏转录组的微生物总功能注释。基于功能特征的自动标度丰度(cpm)，对eggNOG的功能类别(a)和表达基因(b)进行的主成分分析。利用基于功能类别(c)和表达基因(d)的Spearman相关系数计算T-宏转录组和M-宏转录组之间的相关性。c和d中的每个散点图表示每个功能类别和每个表达基因的log10转化的平均丰度(cpm)。使用Euclidean作为距离度量，Ward作为聚类方法，基于功能类别的自动标度丰度(cpm)进行的聚类分析结果显示，方法间的变异小于样本间的变异。
4. 瘤胃中活跃微生物的组成概况
T-宏转录组鉴定得到代表细菌16S rRNA的V1-V3区（804,390±63,802；均值±SEM）的38,610,728个序列和代表古菌16SrRNA的V6-V8区的（15,538±1388）的745,816个序列，其中有42.15%和64.39%的细菌序列可分别被归类为属和种（补充文件：表S1）。
T-宏转录组所得基因组中，有15个可归类到门，108个到属，24个归为古生菌种（补充文件1：表S1）。优势菌门为拟杆菌（26.32±1.34%），其次为厚壁菌（25.74±0.91%）、螺旋体(12.81±0.99%)和变形杆菌(11.04±1.54%)。优势菌属为普雷沃特氏菌(11.94±0.49%)、密螺旋体(11.25±0.95%)和未命名琥珀酸弧菌(8.98±1.50%)。优势菌种为芽孢杆菌(6.05±0.29%)和纤维杆菌(6.01±0.64%)。瘤胃古菌以甲烷短杆菌为主(27.58±1.82%)，其次是未归类的甲烷杆菌-硅藻科(19.53±1.12%)、ISO4-H5第12群(甲烷假单胞菌科附属；11.05±1.20%)和戈特氏甲烷短杆菌(10.22±1.09%)(图4和附加文件1：表S1)。
5. 品种对瘤胃微生物群落的影响
图4显示三个品种肉牛瘤胃中检测到的不同微生物类群。主坐标分析显示，Kinsella杂交牛的瘤胃细菌和古菌群落与安格斯牛和夏洛来牛的不同(图5)，即使品种不影响α多样性指数(Kruskal-Wallis检验P> 0.05；附加文件2：表S2)。基于相对丰度的反正弦平方根数据表明，大约50%的微生物类群（包括8个细菌门，55个属水平的分类群和10个种水平的古生菌分类群）受品种的影响（附加文件1：表S1)。此外，表1显示Kinsella杂交牛的进食频率(29.73±1.99次/天)明显低于安格斯牛(37.63±1.61次/天)和夏洛来牛(36.59±1.56)次/天；P=6.30E−03)；安格斯牛和夏洛来牛的采食量(干物质采食量分别为10.73±0.27和10.33±0.28 kg/d)显著高于Kinsella杂交牛(9.27±0.28 kg/d；P=3.23e−03)；三个品种牛的瘤胃体积有显著差异(P=1.36e−02)。
图6a显示Kinsella杂交牛的瘤胃微生物与安格斯牛和夏洛来牛在DNA水平上显著不同，，而在RNA水平上差异不明显（图6b，c）。
图4 三个肉牛品种中最丰富(排名前十)的瘤胃微生物类群的相对丰富度(细菌在门和属水平，古细菌在种水平)。ANG，安格斯；CHAR，夏洛来；HYB，Kinsella杂交牛。
图5 使用主坐标分析可视化三个品种肉牛的瘤胃微生物总功能类别。基于Bray-Curtis相异度，分别在细菌属水平和古菌种水平进行主坐标分析。3个主坐标被用来绘制细菌(a)和古生菌(b)的相异性。
图6 三个品种肉牛的微生物功能概况。基于功能特征的自动标度丰度(cpm)，对来自宏基因组(a)、T-宏转录组(b)和M-宏转录组(c)数据集的eggNOG功能分类进行主成分分析。
6. H-RFI组和L-RFI组之间的微生物组成差异
在细菌水平上，夏洛来牛RFI组间的厚壁菌门（L-RFI：28.56±1.82％；H-RFI：22.45±2.14％；P=0.042）和绿弯菌门的相对丰度（L-RFI：0.05±0.01％；H-RFI：0.03±0.01％；P=0.046）有差异，然而安格斯和Kinsella杂交肉牛RFI组间的微生物相对丰度在门水平上无差异。表3显示Kinsella杂交牛，安格斯牛，夏洛来牛RFI组间分别有22个、1个和16个属水平的分类群差异显著(P<0.05)。
在古菌水平上，Kinsella杂交牛和夏洛来牛RFI组间分别检测到多种微生物类群的丰度存在差异，但安格斯牛中的的两个RFI组之间未检测到差异古菌（表3）。同时，Kinsella杂交牛RFI间的微生物群落多样性差异有统计学意义(P=0.04)。夏洛来牛RFI组间的古细菌群落的逆辛普森指数（P=0.03)和辛普森均匀度(P=0.03)，以及细菌群落的辛普森均匀度(P=0.03)差异显著(表4)。
三个品种肉牛RFI组间的微生物群落分类特征大多数都有差异，除Kinsella杂交牛和夏洛来牛的4个属级细菌(劳特氏菌、未分类梭状芽孢杆菌、未命名的莫吉细菌科和未命名的R4-45B)外。表3显示这些瘤胃微生物丰度较低(<0.5%)，并且，在Kinsella杂交牛和夏洛来牛中，L-RFI组的丰度均高于H-RFI组。
表3 三个品种肉牛RFI组间差异微生物类群的相对丰度
基于相对丰度的反正弦平方根变换，使用品种内的t检验得到H-RFI组和L-RFI组之间的P值
表4 不同RFI值肉牛α多样性指标比较
如果P值不小于0.05，NS值不显著
1为了使样本间的α多样性指数具有可比性，将每个样本的序列数量归一化为细菌(n=274，885)和古菌(n=4263)的最低reads
2使用Kruskal-Wallis秩和检验获得每个品种内H-RFI组和L-RFI组之间的P值
7. H-RFI组和L-RFI组之间的微生物功能差异
在M-宏转录组水平上，安格斯肉牛L-RFI组的“RNA加工和修饰”功能丰度高于H-RFI组（P=0.021）。在宏基因组水平上，夏洛来牛H-RFI组的“细胞周期控制”和“次级代谢物生物合成”功能丰度高于L-RFI组（P=0.008；P=0.033）。同时，在宏转录组水平上，RFI组之间也存在功能注释的显著差异（T-宏转录组：4个功能注释；M-宏转录组：2个功能注释），表5显示H-RFI组的“翻译，核糖体结构和生物发生”和“转录”功能的表达水平比L-RFI组高（P<0.05）。对于Kinsella杂交牛，H-RFI组在宏基因组水平上的“细胞内运输，分泌和囊泡运输”功能丰度（P=0.001）和宏转录组水平上的“细胞运动性”功能丰度，均高于L-RFI组（P=0.044；P=0.013）。而“核苷酸运输与代谢”和“细胞骨架”功能丰度仅在T-宏转录水平上有差异（P=0.010，P=0.036)。
宏基因组水平上， RFI组间有932个基因（基因覆盖范围40-6067×）存在丰度差异：夏洛来牛组有591个，Kinsella杂交牛组有216个，安格斯牛组有1个，有124个基因在夏洛来牛组和Kinsella杂交牛组中有重叠。T-宏转录组水平上， RFI组间有38个差异表达基因（基因覆盖范围4-186×）：Kinsella杂交牛组有28个，夏洛来牛组有10个。M-宏转录组水平上， RFI组间有14个差异表达基因（基因覆盖范围57-976×）：Kinsella杂交牛组中12个，夏洛来牛组中2个（图7a-c）。并且，H-RFI组中观察到的差异基因/转录产物丰度均高于L-RFI组（图7a-c）。
值得注意的是， RFI组间在DNA和RNA水平上仅同时检测到三个差异基因：两个在宏基因组和M-宏转录组（编码2，3-二磷酸甘油非依赖性磷酸甘油变位酶和编码富马酸还原酶/琥珀酸脱氢酶黄素蛋白结构域蛋白的基因）中发现，一个在T-宏转录组和M-宏转录组（编码磷酸转酮酶的基因）中发现（图7d）。
即使在宏基因组水平上，夏洛来牛组和Kinsella杂交牛组的RFI组间某些微生物基因差异丰富（图7a），但并未发现功能类别（在DNA或RNA水平）或表达的基因在三个品种肉牛的RFI组之间存在差异（表5和图7b，c）。这表明微生物群-宿主相互作用模式决定了每个肉牛品种的饲料转化率。
表5 三个品种肉牛的RFI组间差异功能类别丰度值
每百万reads的cpm计数
在每个品种中使用DESeq2获得H-RFI和L-RFI之间的P值
图7 (a)、(b)、(c)、(d)分别显示从宏基因组、T-宏转录组、M-宏转录组数据集以及三个数据集中确定的RFI组间的差异基因/转录产物数量。H-RFI(+)and L-RFI(+)分别表示H-RFI组和L-RFI组中富集的基因/转录产物数量。
结论
1.宏转录组学比宏基因组学更能代表微生物群的实时功能活动，更适用于研究瘤胃微生物与宿主功能之间的关系。
2.富含mRNA的代谢组学最好用于研究特定的基因和/或代谢途径，特别是低表达水平的基因和代谢途径，而基于总RNA的代谢组学最好用于将瘤胃微生物组的整体组成和功能谱与宿主表型联系起来
3.三个品种肉牛的瘤胃微生物组成(宏转录组水平)和功能潜力(宏基因组水平)存在差异，但功能活性(宏转录组水平)差异不明显。
4.高饲料转化率牛和低饲料转化率肉牛的瘤胃微生物特征(如类群、多样性指数、功能类别和基因)存在差异，其中大部分存在品种特异性。
5.与宏基因组学相比，宿主品种和瘤胃微生物群之间的交互作用影响肉牛饲料转化率，可以通过选择育种来调控瘤胃微生物群。
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