科研 | 中国农业大学Gut：异常肠道菌群改变宿主代谢组并影响人类和啮齿动物的肾衰竭
编译：莫莫，编辑：小菌菌、江舜尧。
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肾功能衰竭患者表现出的尿毒症症状，可能是由肠道微生物引起的。本研究旨在探讨终末期肾病（ESRD）患者肠道微生物组分、尿毒症毒素与肾功能衰竭症状之间的关系。收集223名ESRD患者和69名健康对照者的肠道微生物群、血清和粪便代谢组和人类表型的特点，使用多维数据整合揭示这些数据集与慢性肾脏病（CKD）啮齿动物模型之间的联系，以检测肠道微生物对毒素积累和疾病严重程度的影响。
结果显示有一组在ESRD患者富集的微生物与患者的临床变量密切相关，编码与毒素和次级胆汁酸合成有关的功能；功能微生物的相对丰度与这些代谢产物在血清或粪便的浓度有关。将ESRD患者的肠道微生物移植到无菌小鼠或经抗生素治疗的肾损伤的大鼠体内比对照组更能诱导血清尿毒症毒素的产生，并加重肾纤维化和氧化应激。其中的两个物种，Eggerthella lenta（迟缓埃格特菌）和Fusobacterium nucleatum（具核梭杆菌），在CKD大鼠模型中促进尿毒症毒素的产生并促进肾脏疾病的发展。益生菌动物双歧杆菌减少了这些有害微生物的丰度，降低了毒素水平和延缓疾病的严重程度。ESRD患者肠道菌群异常可导致不良代谢，促进疾病发展，提示肠道菌群是治疗患者尿毒症的理想靶点。
论文ID
原名：Aberrant gut microbiota alters host metabolome and impacts renal failure in humans and rodents
译名：异常肠道菌群改变宿主代谢组并影响人类和啮齿动物的肾衰竭
期刊：Gut
IF：17.94
发表时间：2020年4月2日
通信作者：任发政，于政权； Stanislav Dusko Ehrlich
通信作者单位：中国农业大学；法国农业科学研究院
前言
终末期肾病（ESRD）是慢性肾脏病（CKD）的晚期阶段，在世界范围内发病率高和死亡率高。目前，ESRD的治疗费用惊人，仅在美国一年的花费则高达340亿美元。CKD进展至ESRD及其并发症与血液和其他代谢组织中有毒代谢物的积累密切相关。这些毒素中很大一部分是肠道菌群衍生的，通常不能通过透析有效清除。CKD患者肠道菌群结构的显著改变和ESRD血液透析患者血液和粪便代谢成分的破坏表明CKD存在基于微生物群的代谢失调。然而，来自于微生物的ESRD相关代谢物（如尿毒症毒素）以及肠道菌群介导的ESRD代谢物变化的机制尚未完全研究清楚。如最近一项研究所揭示的，特定肠道微生物的调节可调控循环尿毒症毒素硫酸吲哚酚的浓度，为发现新的治疗方法提供可能性。
在此，我们进行了一项综合研究，通过223名血液透析患者和69名健康对照者的大规模队列研究（按年龄、体重和饮食模式匹配）和24名患者的独立验证队列，获取肠道微生物、血清及粪便代谢组、基于临床和问卷调查得出的数据(表型）等，整合形成多维数据集。
结果
采用非靶向质谱法（MS）对不同血清样品的ESRD患者和健康人的血清进行了代谢组学分析，得到了180种带注释的血清代谢产物的丰度分布。ESRD组和对照组血清代谢组明显不同（图1A）；180种代谢物中有134种具有显著不同的丰度。鉴于因原发性疾病引起异质性，我们将ESRD按原发病分为三组：肾小球肾炎（n=76）、糖尿病肾病（n=73）和其他（n=74），并分别与对照人群进行比较。这三个组的代谢组差异是类似的，虽然血清代谢物中≥97%在整个人群中显示为不同，但只有少量代谢物（<9%）在不同组中具有显著不同的丰度。这表明ESRD血清代谢组在很大程度上与原发病无关。有趣的是，我们发现性别对ESRD患者的血清代谢组有中度影响且有统计学意义（p=0.018，R2=1.7%）。与之相一致的，ESRD状态是导致患者和健康者血清代谢组差异的主要原因（图1B），因为它解释了接近11%的差异，而其他生物临床变量（如性别、体重和总血胆固醇浓度）共同解释了额外的8.5%；三种主要的原发性疾病类型对血清代谢无明显影响。
ESRD血清代谢组的主要特征是九种尿毒症毒素的富集和胆汁酸组成的不平衡（例如，结合胆汁酸与非结合胆汁酸以及初级胆汁酸与次级胆汁酸（SBA））（图1C）。通过对60名患者（ESRD患者，n=40；健康对照组，n=20）随机选择子集中的目标代谢物进行量化，确认ESRD患者中尿毒症毒素的累积。据报道，除了由胆碱和肉碱产生的氧化三甲胺（TMAO），其他毒素是由肠道微生物群通过饮食衍生的芳香族氨基酸（AAAs）和苯酚的降解产生的。类似的，胆汁酸的循环组成与肾脏疾病有关，已知受肠道微生物影响。我们对血清代谢物进行了聚类分析，并研究了聚类丰度与用于评价CKD进展的临床指标（如血肌酐和肾小球滤过率）的相关性。重要的是，尿毒症毒素和胆汁酸与整个队列中的相关临床指标密切相关；在单独的患者和对照组中也观察到显著的相关性。这些发现，与以前的研究一致，说明了这些循环代谢物对患者临床状态的生理重要性。
ESRD组和对照组的粪便代谢组明显不同（图1D）。具体而言，255种标注粪便代谢物中，98种在两组之间的丰度存在显著差异。尿毒症毒素前体和次级胆汁酸在患者粪便中富集，而初级胆汁酸、短链脂肪酸（SCFAs）和SCFA衍生物（如甲基丁酸和甲基丙酸）明显减少；这些化合物占粪便代谢组变化的49.6%。至于粪便代谢组，三个原发病组中的两个（肾小球肾炎和其他）与对照组有非常相似的差异。糖尿病肾病的相似性稍低，即使大多数64%的粪便代谢物仍然被回收。组间比较证实了糖尿病肾病代谢组的差异，高达23%（255例中的58例）的代谢产物具有差异丰度。尽管如此，除了对甲酚外，尿毒症毒素前体或胆汁酸并没有显著差异，对甲酚在糖尿病肾病中更为丰富。性别对ESRD患者粪便代谢无显著影响（p=0.463，R2=0.43%），但对血清代谢组有显著影响。值得注意的是，处于ESRD这一阶段再次成为患者组和对照组粪便代谢组差异的主要原因，即使它解释了很少比例的差异（4.2%），其他生物临床变量（如临床指标、药物等）仅解释了其他了5.8%的差异。糖尿病状态也是引起差异的一个重要因素。
普氏分析显示血清和粪便代谢谱具有很强的协同性（图1F）。最重要的是，血清尿毒症毒素与其粪便前体密切相关，这表明ESRD患者肠道的代谢变化对血清中尿毒症毒素的积蓄起推动作用。
为了进一步验证我们的代谢组学结果，我们另外设计了一个独立队列，包括12名ESRD患者和12名健康对照组。ESRD患者血清尿毒症毒素的积蓄在新队列中得到证实；同样，在ESRD患者粪便中，观察到毒素前体升高，并伴有明显的SCFAs和SCFA衍生物减少的趋势。大多数（8/13）但并非所有代谢物均达到统计学显著性（q<0.1），可能与验证队列规模小有关。
3.ESRD患者的肠道菌群分类和功能特征
为了研究肠道菌群是否介导了ESRD患者的代谢组学变化，我们通过鸟枪法宏基因组测序分析了肠道菌群，在IlluminaHiSeq平台上，每个粪便样本平均产生7470万个reads（11.2 Gb数据）。我们利用测序数据收集了1140万个非冗余基因的基因目录，它们代表了我们这个队列群体的微生物群。这些基因被注释到11867个 KEGG功能分类中，并被组织成900个亚基因组物种（MGS），其中约66%可以被分配到已知的属，突出了一个相当大的有待探索的新颖性。
利用基因图谱，我们首先发现ESRD患者微生物群的微生物多样性、分类组成和功能潜力与健康人有显著差异。ESRD患者中约有269个富集MGS、188个缺失（图2A）；补充材料表10中列出了164个在种和/或属水平上的分类。由于我们队列中超过一半的物种发生了显著变化（457/900 MGSs，51%），我们得出结论：ESRD状态明显影响微生物群。ESRD患者体内最富集的物种包括Eggerthellalenta（迟缓埃格特菌）,Flavonifractor spp (mainly F. plautii), Alistipes spp (mainly A. finegoldii 和 A.shahii), Ruminococcus spp和 Fusobacterium spp（具核梭杆菌）（图2B）。丰度减少的物种有包括普雷沃菌属、梭状芽孢杆菌属和几种产丁酸盐菌（Roseburia spp, Faecalibacteriumprausnitzii 和Eubacteriumrectale；图2）。ESRD患者粪便中SCFAs的减少可能是由于产生SCFA的微生物减少。
ESRD肠道菌群在氧化应激抵抗中的功能表达明显，这可能是由于患者的炎症程度较高。氨基酸生物合成和降解所需的功能分别被耗尽和富集，可能反映了ESRD患者氨基酸利用率的增加。与AAA降解和SBA生物合成相关的功能模块和酶被富集，与尿毒症毒素前体和SBA在粪便代谢组中的富集一致。此外，这些功能与血清和粪便中相应ESRD相关代谢物的浓度显著相关（图2C）。我们的结论是，ESRD患者尿毒症毒素的富集与肠道微生物群介导的AAA降解和微生物SBA生物合成有关。
为了进一步探讨肠道微生物群与代谢组之间的关系，我们对肠道MGSs、血清和粪便代谢物的丰度进行了组间相关分析。在ESRD患者和健康对照组中都发现了紧密的联系（图3A，B）。然而，ESRD相关网络与健康对照组明显不同，因为只有约12%的相关性是常见的。值得注意的是，尿毒症毒素和胆汁酸占ESRD患者血清代谢物相关性的95.0%，明显高于健康对照组（69.3%）。然而，在两组中，MGSs、尿毒症毒素和胆汁酸之间的相关性在方向（阳性或阴性）和强度方面保持不变，在对照组中稍高，进一步支持肠道微生物群影响这些化合物水平从而影响疾病进展的发现。同样重要的是，ESRD患者的血清尿毒症毒素和胆汁酸也受到肠道菌群和粪便代谢组的显著影响（图3C）。
肠道菌群对ESRD患者代谢谱的影响相当大，它分别占血清和粪便代谢组变化的31.3%和39.0%(图3D)。类似的效应大小(血清代谢组变化的20%-40%)在三项独立研究中显示出来，这三个独立研究涉及肥胖个体、心血管疾病患者或糖尿病患者。重要的是，在ESRD患者(分别占血清和粪便代谢组变异的15.4%和12.5%)和健康对照组(分别占血清和粪便代谢组变异的12.6%和14.4%；图3D)中，宿主表型对代谢组的影响明显小于肠道微生物组对代谢组的影响。这些结果表明，除肾脏功能外，肠道微生物似乎是宿主粪便和血清代谢的重要决定因素。
非抗生素药物会影响肠道微生物，因此也可能影响代谢产物。我们对ESRD患者的治疗进行了总结。Adonis单变量分析表明，大多数药物没有显著的疗效。只有一种左旋卡尼汀对血清代谢物达到显著和预期的影响(图1B)；它可能与肉碱水平升高有关。糖尿病相关药物影响粪便代谢组和MGS组成；因此，它们可能在一定程度上推动糖尿病状态对代谢组组成的影响。贫血相关药物也会影响粪便代谢组成分。在所有病例中，药物的效果都相当温和，接近1%(图1B和E)。由于我们的患者平均使用了四种不同的药物，我们还进行了多因素分析，重点放在单一有效(p<0.05)或接近有效(p<0.1)的药物上。结果表明，这些药物的组成没有明显影响。饮食是ESRD患者和健康对照组之间组学差异的另一个潜在混淆因素。然而，在我们的队列中，根据内含117个项目的食物问卷得出的9种主要食物类别中，除了对照组略有增多小麦/大米(p=0.04)外，其他几乎没有差异。方差分析的置换多变量分析进一步表明，上述食品类别对代谢组和微生物组没有显著影响。药物和饮食对粪便代谢组或微生物组的影响很小，很可能是因为透析前的水平代表了一个极端的毒性状态。
为了进一步证实肠道微生物在生产尿毒症毒素和SBAs中的潜在作用，我们重点研究了预测编码这些化合物主要合成途径中关键酶的微生物基因。我们在我们的基因目录中鉴定了编码6种主要尿毒症毒素和SBAs关键合成酶的5134个基因。这些基因在ESRD患者和富含ESRD的微生物物种中明显更丰富。粪便中的代谢物浓度与同源合成酶编码基因的丰度呈正相关。在这些发现的指导下，我们应用随机森林模型来确定每种毒素或SBA与含有毒素/SBA合成酶编码基因的物种丰度之间的相关性。最大化毒素强度和血清或粪便中SBAs浓度的随机森林预测模型确定了大约83种物种(图4)。这些模型平均解释了血清或粪便中目标代谢物浓度变化的26%，这表明相应的物种在很大程度上促进了毒素和SBA的产生。与ESRD患者尿毒症毒素和SBAs增加一致的是，大多数物种(59%)在患者组比对照组更丰富(图4)。考虑到毒素和SBAs的浓度也可能不受合成途径(如代谢物运输)的影响，我们扩展了随机森林模型，将缺乏合成酶的物种包括在内，可以解释额外的13%的差异。可能来说，毒素和SBAs的肠道微生物群驱动甚至更明显，因为我们的模型基于可以由当前方法构成的MGS，许多其他可能仍有待发现。
重要的是，与尿毒症毒素或SBA产生相关的物种与最重要的ESRD临床指标直接和强烈相关。特别是，eGFR和肌酐、尿素、C反应蛋白、血红蛋白的循环水平在很大程度上是由菌群丰度决定的(平均为50.8%)。因此，我们假设肠道微生物群至少部分通过尿毒症毒素和SBAs加重了ESRD。
上述的基于物种模型的ROC曲线下面积为0.97，明显高于为代谢和心血管疾病分类而开发的肠道微生物模型所报告的值。在该模型中，真细菌属(Eubacterium spp)、黄曲霉属(Flavonifractor spp)和迟缓埃格特菌（Eggerthellalenta）是主要的始作俑者。这些发现提示参与尿毒症毒素和SBA产生的微生物可作为ESRD的诊断标志物。
6. 调整CKD大鼠模型的肠道菌群可影响毒素的蓄积和病情进展
为了检验我们的假设，即肠道菌群至少在一定程度上通过尿毒症毒素促进肾功能衰竭发展，我们将来自ESRD患者或健康捐赠者的新鲜肠道菌群移植到腺嘌呤诱导CKD模型的无菌小鼠身上。移植后，受体小鼠有效地重新获得了患者组或健康组供者肠道菌群的分类特征(图5A)。因此，与接受来自健康捐赠者肠道菌群的受体小鼠相比，接受ESRD肠道菌群的小鼠表现出更严重的肾脏纤维化、肾小球硬化和氧化应激，以及血清尿素和肌酐水平的增加(图5B，C)。随之而来的是，接受ESRD微生物治疗的小鼠血清中几种尿毒症毒素的水平，包括硫酸对甲酚、苯乙酰甘氨酸、苯硫酸盐和硫酸吲哚酚水平显著升高(图5D)。一致地，在一项抗生素治疗后微生物耗竭的5/6肾切除CKD大鼠进行粪便菌群移植(FMT)，该平行实验中也观察到了类似的结果。总而言之，这些结果证明了ESRD患者肠道菌群失调通过影响尿毒症毒毒素加重肾脏疾病发展。
我们接下来验证这样的假设，即在未改变的肠道菌群中存在能够产生尿毒症毒素前体的物种可加剧肾脏疾病的进展。为此，我们使用了两个物种，参与生产马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺的Eggerthellalenta（迟缓埃格特菌）和参与生产吲哚和苯酚的Fusobacteriumnucleatum（具核梭杆菌）。在5/6肾切除CKD大鼠模型中，Eggerthella lenta（迟缓埃格特菌）和Fusobacterium nucleatum（具核梭杆菌）灌胃显著增加了它们在粪便中的丰度，但对总体肠道菌群组成没有显著影响。重要的是，与假喂养的大鼠相比，尿毒症大鼠血清尿毒症毒素水平显著升高(图5E)，同时伴有严重的氧化应激、肾小球硬化、肾纤维化以及血清肌酐和/或尿素水平的升高(图5F，G)。此外，Eggerthella lenta（迟缓埃格特菌）和Fusobacterium nucleatum（具核梭杆菌）的相对丰度与其对应的血清尿毒症毒素浓度直接相关。这些发现与以往研究中对CKD大鼠灌胃尿毒症毒素的效果是一致的。这些结果表明，细菌产生尿毒症毒素可加重肾脏疾病。
可推断，肠道菌群在肾脏疾病中的直接作用是，驱动肠道菌群丰度的降低应该会减轻疾病的严重程度。因此，我们给CKD大鼠灌胃动物双歧杆菌A6(一种促进健康的益生菌)后发现，即使微生物群的总体组成没有明显改变，两个毒素驱动物种Eggerthella lenta（迟缓埃格特菌）和Fusobacterium nucleatum（具核梭杆菌）的丰度也显著下降。同时，血清尿毒症毒素、肌酐和尿素浓度显著降低，肾脏纤维化和肾小球硬化减轻。这些结果表明，该益生菌可以通过调节毒素驱动的种类来延缓CKD模型大鼠肾脏疾病的发展。
讨论
在这项工作中，我们证明了肾功能衰竭患者的肠道菌群出现严重失调，因而促进一些有毒化合物的生物合成，导致尿毒症毒素的血浆浓度升高，加速肾脏疾病的发展(图6)。大多数产毒菌种在ESRD患者者富集，且与患者的临床参数高度相关。Eggerthellalenta（迟缓埃格特菌）是ESRD患者中富集程度最高的微生物之一，据预测与几种毒素的产生有关，包括马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺和SBAs。Eggerthella lenta（迟缓埃格特菌）一直参与将多酚降解为苯甲酸或4-羟基苯甲酸，这两种物质是马尿酸的前体，并且具有使心脏药物地高辛失活的酶。另一个重要的产毒菌种Fusobacteriumnucleatum（具核梭杆菌）被发现参与吲哚和苯酚的产生。值得注意的是，在ESRD富集的细菌中，Alistipes shahii （沙氏别样杆菌）主要产生吲哚，Clostridium difficile（艰难梭状芽孢杆菌）主要产生对甲酚。同时，我们还鉴定了生成苯乙酰谷氨酰胺、苯硫酸盐和马尿酸等毒素的物种，而这些毒素尚未得到充分的研究。此外，本研究还表明，ESRD患者肠道代谢的改变对尿毒症毒素在血清中的蓄积有重要作用。总之，ESRD富集产毒微生物是ESRD患者肠源性尿毒症毒素积累的原因。
这项工作有助于在人类受试者中建立肠道微生物和肾脏疾病进展之间的因果关系。一些肠道微生物来源的尿毒症毒素，包括硫酸吲哚酚、硫酸对甲酚、苯乙酰谷氨酰胺和氧化三甲胺，在CKD和ESRD患者中都升高，并与CKD的进展、死亡率、主要不良心血管事件和其他严重的临床终点有关。硫酸吲哚酚、硫酸对甲酚等毒素，已被实验证明能诱导CKD大鼠肾脏纤维化和显著的肾小管损伤。Eggerthella lenta（迟缓埃格特菌）和Fusobacteriumnucleatum（具核梭杆菌）灌胃可提高5/6肾切除大鼠血清相应毒素水平，加重肾纤维化程度。这些发现支持了ESRD患者富集产毒微生物在疾病发展中的重要性，并强化了肠源性尿毒症毒素增加会加剧肾脏疾病进展。ESRD患者的肠道屏障经常受损，促进尿毒症毒素前体进入循环系统，这将有助于血清毒素的积累。已有研究表明，尿毒症患者普遍存在的全身炎症可能部分归因于他们的肠道屏障功能受损。我们最近的研究结果表明，来自尿毒症患者的肠道菌群可能会产生大量苯酚，从而破坏肠道屏障。随着肠道屏障的受损或破坏，更多的尿毒症毒素可以渗透到ESRD患者的循环中，加剧肾脏疾病及其并发症的发展。
定期接受透析治疗的肾衰竭患者，就像本研究中纳入的患者一样，患有毒素诱导的残余尿毒症综合症，这种情况严重影响了他们的生活质量。ESRD患者体内毒素积聚的原因之一是某些肠道微生物来源的尿毒症毒素不能通过传统的透析有效地清除。因此，在未来不同程度肾功能受损患者的临床对照试验中，主要需要探讨通过饮食、益生菌或其他治疗手段调节肠道菌群是否可以缓解残留综合征的破坏性症状，提高生存和生活质量，或者推迟进入透析治疗或肾移植。
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