科研 | Microbiome ：饮食诱导的慢性肠病的缓解与微生物群落结构的改变及继发性胆汁酸的合成有关
编译：Blanche，编辑：小菌菌、江舜尧。
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人类炎症性肠病（IBD），如：克罗恩病和溃疡性结肠炎，是一种由多因素导致的疾病，其发生伴随着免疫病理变化、肠道紊乱、肠道微生物结构改变。一些证据表明，肠道细菌是IBD发病的重要因素。已经从菌群结果、免疫反应敏感性、粪便菌群移植方面得到了证实。老鼠的流行病学数据和研究表明，高脂肪、低纤维、乳化剂等饮食添加剂，是IBD的危险因素，在某些情况下可以直接损害导致疾病的肠道屏障功能。饮食也可以用来治疗IBD，如使用肠内营养（EEN）作为儿童克罗恩病的一线治疗方法。饮食、微生物群结构和肠病之间的关系很难从饮食难以控制的人体研究中分离出来，因此需要结合广泛的食物摄入调查进行回顾性研究、对照研究、或关注生活方式不同的人群。研究表明，狗是一种理想的动物模型，可以介绍肠道疾病与饮食微生物群相互作用。首先，作为同伴动物，狗与人类生活环境相似，其胃肠道病理学特征，治疗易感位点、疾病相关的微生物类群也表现出相似性。其次，最近的一项宏基因组研究，对超过100万个犬肠道微生物基因进行分类和功能注释，并表明与其他哺乳动物（如小鼠和猪）相比，犬体内的微生物环境与人类最为相似。第三，不同蛋白质/碳水化合物的饮食显著改变了犬的微生物群，其方式类似于人类。该动物模型能够严格研究治疗饮食、微生物组群和疾病之间的关系。
论文ID
原名：Diet-induced remission in chronic enteropathy is associated with altered microbial community structure and synthesis of secondary bile acids
译名：饮食诱导的慢性肠病的缓解与微生物群落结构的改变及继发性胆汁酸的合成有关
期刊：Microbiome
IF：9.86
发表时间：2019
通讯作者：Daniel P. Beiting
作者单位：宾夕法尼亚大学
实验设计
本研究中，基于基因测序对患有慢性肠炎的狗进行检测，探究在给与治疗性水解蛋白饮食治疗后，粪便微生物群落结构和代谢产物的变化。比较DR组与NDE组，随时间的变化水解蛋白饮食对肠道微生物群落结构和功能的重塑。
结果
1 饮食疗法能迅速而持久地缓解
29只慢性肠病犬参加营养治疗法实验。饮食改为治疗性水解蛋白，用犬慢性肠病临床活动指数进行评价。结果显示，在接受治疗性饮食2周后，69%（20/29）的动物得到缓解，平均疾病评分从4.1（95%CI=4.8-3.3）降至1.3（95%CI=1.8-0.7），在实验的后期，饮食反应（DR）无需额外的干预（图1a）。在研究结束时（第42天），饮食反应（DR）动物的平均疾病评分为0.9（95%CI=1.3-0.6），与第0天相比，疾病严重性降低了4倍以上（图1b）。相比之下，31%（9/29）的动物在治疗性饮食2周后没有表现出疾病评分的显著降低（图1c）。
图1 饮食治疗中与治疗结果相关的微生物群落学鉴定
2 与治疗结果相关的微生物群落结构的鉴定
3 治疗性饮食减少与慢性肠病相关的失调
为了评估饮食诱导的缓解是否伴随着失调的改变，比较饮食反应动物在给药前和给药后的微生物群落结构。尽管系统发育距离和香农多样性没有改变（图S4A-B），但在14天的饮食治疗后，观察到群落均匀度有明显的增加（图2a 、图S5），重点是样本中最丰富的前40个OTU，占总读取量的83%。基于未加权（图S4C）或加权（图S4D）UniFrac的主坐标分析（PCoA）显示，即使在给药前的第0天，狗之间也存在可测量的分离。饮食治疗后14天和42天，群落结构发生转变（图S4C和D）。这一变化明显高于健康组的异质性，表明饮食疗法的影响（图S4E）。比较每个时间点加权（图2b）或未加权（图S4F），饮食反应动物与健康动物之间的统一距离，我们观察到饮食诱导的缓解伴随着与健康对照组之间距离的减少，这种趋势持续到第42天，此时与第0天的相似性最低，与健康狗的相似性最高（图2b）。
由于治疗性饮食与饮食反应动物体内微生物群落结构的改变有关，推断饮食干预后粪便微生物群落的组成会迅速改变。采用治疗性饮食后，硬壁菌增加和蛋白质细菌减少（图S4G和H）。在饮食治疗后14天，与治疗前（第0天）相比，饮食反应动物中有14个属的数量存在差异（表S3）。在饮食反应动物中，饮食治疗后与IBD相关的潜在致病性属的代表性不足。例如，在第0天，大肠杆菌、志贺氏菌、敏感梭菌、肠球菌、梭杆菌的相对丰度较高，饮食治疗14天后显著降低。在种水平上，第0天采集的样本与第14天相比，有45个OTU显著差异丰富（图2c，表 S 4）。在本研究的第0天，大肠杆菌在动物中丰度较高（图2d）。治疗2周后，该分类群的相对丰度显著下降，第42天几乎无法检测到大肠杆菌，与在健康狗中观察到的水平无法区分（图2d）。与第0天的样本相比，第14天的样本产气荚膜菌也显著降低（图2e）。与此相反， Blautia的OTUs在饮食治疗后增加（表S4）。综上所述，这些结果表明通过减少致病菌和增加有益的共生类群来改善失调，这是饮食疗法的一个标志。
4 饮食治疗后缓解期特定微生物群的变化
5 饮食诱导的病情缓解与代谢改变和继发性胆汁酸水平升高有关
为了确定微生物群落结构的变化是否会转化为微生物代谢的改变，在开始饮食治疗后的第0天、第14天和第42天收集的粪便样本进行了测序。结果显示，在饮食诱导缓解（第0天与第14天）之前和之后，DR动物之间存在分离（P<0.05）（图3a、b）。差异丰度分析确定了35条整体途径和120条物种水平上的途径，这些途径在DR动物的饮食治疗中相对丰度发生了显著变化（表S6），包括：碳水化合物代谢、次级胆汁酸合成的途径。使用靶向代谢组学，测量健康狗粪便中15种胆汁酸的水平（图S6）。在患有活动性疾病的动物（第0天）中，二次胆汁酸脱氧胆酸（图3e）和石胆酸（图3f）减少。与健康狗相比，在第14天和第42天对DR动物进行饮食治疗后，二次胆汁酸脱氧胆酸和石胆酸显著增加（图3e、f和表S7）。值得注意的是，NDR动物的继发性胆汁酸没有通过饮食治疗升高（图3g，h），这表明这种代谢变化与病情缓解有关。
6 石胆酸和脱氧胆酸抑制大肠杆菌和产气荚膜梭菌的体外生长
7 C、 hiranonis是一种对饮食有反应的物种，能够产生次级胆汁酸
接下来，我们试图确定饮食治疗后石胆酸和脱氧胆酸的潜在来源。一级胆汁酸如何转化为二级胆汁酸。在饮食诱导缓解后，某些梭状芽胞杆菌的OTUs、石胆酸、脱氧胆酸水平增加。宏基因组文库鉴定得到六个梭菌属和两个真细菌属中，C.hiranonis是最丰富的物种之一（图S8）。此外，在饮食治疗后，C.hiranonis的相对丰度显著增加，但在饮食治疗失败的NDR动物（图5a，右）中则没有。亚基因组数据中鉴定出31种含有BSH的物种，其中大多数属于乳酸杆菌属、链球菌属和真细菌属（图5c）。这些物种中的一些与石胆酸或脱氧胆酸显著正相关（表S9和图S7B），强调了含BSH的微生物可能导致这些胆汁酸水平的增加。C.hiranonis是最有可能的次级胆汁酸产生者。
右旋糖酐硫酸钠（DSS）可引发炎症和生物失调，用该物质造模，动物口服PBS或C.hiranonis（图5d）。探究C.hiranonis、继发胆汁酸和CE缓解之间的关系如预期的那样，DSS导致体重显著减轻（图5e）、结肠长度（图5f）、肠道损伤，表现为单个核细胞和中性粒细胞浸润固有层（图5g，h；图S10），增生性隐窝，有丝分裂数目增多，杯状细胞数目减少（图5g，i）。此外，DSS导致胆汁酸失调，表现为粪便中脱氧胆酸水平降低（图5j）。与此相反，DSS治疗的小鼠接受了C.hiranonis后，结肠缩短明显减少（图5f），炎症较轻（图5g，h），仅限于固有层，中性粒细胞较少，杯状细胞数量维持（图5g，i），脱氧胆酸水平保持（图5j）。此外，当在第3天用食品安全的大肠杆菌菌株（Nissle 1917）对小鼠进行预克隆时，DSS治疗导致小鼠在第8天出现显著的细菌扩张（失调）（图5k）。这种扩张在接受平菇的小鼠中明显减少。结合犬模型的结果，这些数据表明，C.hiranonis是一种有益的微生物，与肠道疾病的缓解有关。
图5 C.hiranonis是一种有益的微生物，具有改善肠道疾病的能力
8 C、 scindens与儿童克罗恩病的饮食诱导缓解有关
饮食治疗后狗和人的缓解率都很高，假设在接受肠内独家营养（EEN）治疗的儿童克罗恩病患者中也可能出现类似的bai操纵子诱导的梭菌感染。为了检验这一点，我们分析了从儿科纵向研究的元素膳食和粪便微生物组分的公开数据，这项研究在EN（23）治疗前后检查了大约20名患者，其中一半接受治疗，而另一半失败治疗。对样品进行测序，结果显示，该物种和bai操纵子的显著增加（图6a和b）。值得注意的是，在EEN（反应性，n=10）后进入缓解期的患者中观察到这种增加，但在治疗失败的患者中观察不到（非反应性，n=10）（图6a，b）。此外，对肠易激综合征患者（R=-0.3515，P=0.03287）的粪便钙保护素（FCP）与C.scindens相对丰度的相关性分析表明，饮食反应患者（R=-0.0267，P=0.877）与粪便钙保护素（FCP）呈显著负相关（图6c）。同样，在饮食反应性患者中观察到FCP（R=-0.3944，P=0.0157），但非反应性患者未观察到（R=0.0490，P=0.7766）（图6d）。这些结果表明，无论是动物还是人类，产生胆汁酸的梭状芽孢杆菌都与饮食诱导的病情缓解有关（图6e）。
图6 胆汁酸产生菌C.scindens与儿童克罗恩病的饮食诱导缓解有关
结论
由结果可知，水解蛋白饮食引起的病情缓解与微生物群结构的改善、产生胆汁酸的梭菌数量的增加以及次级胆汁酸水平的增加有关。为饮食诱导缓解胃肠道疾病提供新的思路，有助于指导更有效的治疗饮食的合理设计。
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