科研 | Gut Microbes：补充益生菌会改变肠道微生物组的稳定性

编译：卓求，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

肠道微生物组的稳定性在维持机体健康中扮演了很重要的角色同时肠道微生物组的不稳定也已被发现是很多代谢型疾病的风险因素。摄入的益生菌和土著肠道微生物组之间不可避免的竞争会增加不稳定性。外源性益生元能否和怎样改善补充益生菌后整体肠道微生物组的稳定性仍然不清楚。本研究利用植物乳杆菌HNU082 (Lp082)作为一个益生菌模型，通过鸟枪法宏基因组技术考察持续或间断摄入低聚半乳糖对肠道微生物组稳定性的影响。结果显示，只有持续低聚半乳糖的摄入才可以促进摄入益生菌的生长和降低竞争状态下的单核苷酸多态性突变。此外，持续的低聚半乳糖摄入增加了整体的稳定性，重塑了益生菌与土著微生物组中拟杆菌属细菌的竞争相互作用，碳水化合物活性酶（CAZymes）的过剩也说明了这一点。另外，共793单核苷酸多态性出现在益生菌摄入后的土著微生物组中，其中超过百分之90是来自于编码转座酶、碳水化合物活性酶和膜蛋白的拟杆菌属细菌。然而，在益生菌摄入的过程中，两种低聚半乳糖的摄入均未降低土著微生物内全部的适应性突变。总的来说，持续的益生元摄入对肠道微生物组的生态和遗传稳定性有益。

论文ID

原名：The gut microbiome stability is altered by probiotic ingestion and improved by the continuous supplementation of galactooligosaccharide

译名：补充益生菌会改变肠道微生物组的稳定性而同时持续摄入低聚半乳糖则可以改善肠道微生物组的稳定性

期刊：Gut Microbes

IF：7.74

时间：2020.6

通讯作者：张家超

通讯作者单位：海南大学食品科学与工程学院

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实验设计

1 确定植物乳杆菌HNU082的最佳益生元

根据MRS培养基的体外生长曲线和菌落计数法，从低聚半乳糖（GOS）、低聚木糖（XOS）、低聚果糖（FOS）、水苏糖和菊粉中筛选出Lp082的最佳益生元。通过在基础营养生长培养基（peptone 10 g/L, beef extract 10 g/L, yeastextract 5 g/L, C6H5O7(NH4)3 2 g/L, Tween 80 1 ml/L, CH3 COONa 5 g/L, K2HPO4 2g/L, MgSO4 0.58 g/L, MnSO4 0.25 g/L, pH adjusted to 6.2 with HCl solution）中添加不同的益生元（20 g/L）加以考察评判。生长曲线表明，Lp082在添加低聚半乳糖培养基中的生长能力与在MRS培养基中相似，而活菌数高于MRS培养基。因此，低聚半乳糖被选作Lp082的最佳益生元。

2 动物实验与饮食

48只五周大的雄性C57BL/6小鼠经14天适应性喂养后被随机分到4组（分别是对照组、益生菌组、益生菌加持续低聚半乳糖组和益生菌加间断低聚半乳糖组）。在接下来的4周中通过灌胃给药和同时给予生理盐水的方式为小鼠提供实验饮食，相同体积的生理盐水给予对照组，益生菌组每天喂食8.6 Log10 CFU Lp082，益生菌加持续低聚半乳糖组是在8.6 Log10 CFU Lp082的基础上每天加20 mg低聚半乳糖而益生菌加间断低聚半乳糖组则是在8.6 Log10 CFU Lp082的基础上仅在第一周和第三周每天加20 mg低聚半乳糖。

3 粪便样本收集           

考虑到小鼠的意外死亡，同组12只小鼠在实验一开始就进一步分到了三个笼子并标记，每组选取5-6只小鼠在相同情况下分别与第7、14、21和28天进行粪便样本的收集，粪便样本经液氮冷冻后储存在-40度冰箱中以备检测，四周实验饮食喂养后，小鼠进行脱颈处死。

4 粪便DNA提取，鸟枪宏基因组测序和数据质量控制      

使用QIAamp®DNA Stool Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国）从粪便样品中提取DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳和OD 260/280确定提取的DNA的质量，同时使用NanoDrop 2000（Novogene Company，北京，中国）测量DNA浓度。由Novogene公司（中国北京）的Illumina HiSeq2500仪器进行鸟枪宏基因组测序。文库制备后DNA片段的长度约为300bp。使用Sickle软件对在正向和反向扩增中产生的150 bp配对末端进行修剪，然后将其与小鼠基因组（GRCm38.p6）对比以去除宿主DNA片段。

5 鉴定微生物种类、功能基因、代谢途径和Lp082的丰度

使用默认参数在MEGAHIT中将鸟枪的reads组装为contigs和scaffolds。对于宏基因组物种注释，应用Kraken 2.035和Bracken 2.536软件进行分类学分类。 HUMAnN2是基于UniRef90数据库对宏基因组功能特性和代谢途进行注释。因此，我们通过上述分析获得了肠道微生物组的分类学，基因家族和代谢途径概况。考虑到微生物组数据的组成性质，我们进一步使用基于R包“ composition”的CLR转换丰度进行单变量统计分析。由于益生菌Lp082已进行全基因组测序，我们知道其基因组的每个细节。在计算Lp082的丰度时，首先我们基于菌株的全基因组序列构建了参考基因组数据库。将Lp082参考基因组添加到Kraken数据库中，并通过运行Bracken 2.5软件将每个样品的鸟枪宏基因组测序reads与Lp082参考基因组进行对比，从而在每个样品中生成Lp082的相对丰度。

6 碳水化合物活性酶（CAZYmes）的注释和基因丰度的计算

dbCAN240软件用于识别和注释CAZymes。在这方面，提交由MEGAHIT组装的contigs并使用FragGeneScanv1.31.41对生成蛋白质序列进行预测。蛋白质预测后，Diamond v0.9.2442被用于CAZymes数据库中的快速匹配（E值= 1e-102）。然后，用contigs在MetaGeneMark里预测功能基因。最后，使用CD-HIT构建非冗余基因目录。使用Bowtie245和SAMtools v_0.1.18将reads与基因目录比对以确定基因的丰度。

7 基于鸟枪宏基因组数据的肠道微生物组进化分析

接下来，我们使用MIDAS（基因组内部物种多样性分析系统）来分析肠道基因组数据库，其中包括高丰度的本地物种和与Lp082密切相关的物种。然后，使用与单基因组分析相同的方法，将鸟枪宏基因组测序reads与数据库对比，以调用每个肠道物种的SNP。从对照组样本中鉴定出的SNP被设置为在以下时间点评估每个单一物种细菌突变的参考。

结果

1 持续的低聚半乳糖摄入促进益生菌的定植并在肠道选择压力下提高其遗传稳定性

为了描述每组食用后益生菌的时间动态，我们首先将宏基因组序列定位到Lp082的参考基因组，以计算该菌株在每个粪便微生物组中的相对丰度。益生菌干预后，在3个治疗组中，益生菌Lp082的平均相对丰度为0.025％（从宏基因组读取中注释），仅为土著微生物的不到千分之一。我们发现，当不补充GOS时（即在PRO组中），摄入益生菌的相对丰度随着时间的推移持续下降，这可能是由于土著肠道微生物组的选择性压力引起的。益生菌的丰度随时间波动更大，并且与间断GOS补充的GOS补充时机高度相关（图1b）。它从第7天下降到第14天，从第14天上升到第21天，然后在第21天后下降。相反，在连续补充GOS的情况下，其相对丰度随时间变化明显稳定（图1b）。这些结果表明，GOS补充可以有效增强摄入的益生菌在肠道微生物组中的定殖。

接下来，我们对探究土著肠道微生物组的选择性压力下GOS摄入对益生菌群体遗传稳定性的影响感兴趣。首先，通过将所测宏基因组序列与Lp082的参考基因组对比以确定每个粪便微生物组中该益生菌基因组上的单核苷酸多态性（SNP）。从所有粪便微生物群中注释了该益生菌菌株上的总共28个SNP。如果不添加GOS，则在定植的第一个14 天内，益生菌SNP的总数（平均8-9）相对于添加GOS的总数（图1c-d）相对较高，而在第14 天后则降低（平均6）。在间断式补充GOS的情况下，益生菌获得的适应性突变的数量与补充GOS的时间有关。在整个摄入过程中，持续补充GOS显着降低并稳定了摄入益生菌的突变频率。从突变频率分布图中，我们发现某些SNP在PRO和GPC组之间的频率显著不同。这些SNP主要位于编码饥饿诱导DNA结合蛋白的dps基因和编码细胞表面粘附蛋白的lp_2588基因上。

 

图1 实验设计和宿主肠内Lp082的适应性进化。（a）实验设计：对照（n = 5只动物），PRO（n = 6只动物），GPC（n = 6只动物）和GPP（n = 6只动物）。（b–c）三组中Lp082的相对丰度和突变频率（SNP）的时间动态，误差线：平均值±SD。（d）每个SNP位置都标记在Lp082的参考基因组上。

2 持续的低聚半乳糖摄入稳定了由益生菌摄入引起的土著肠道微生物组的结构波动

接下来，我们试图阐明土著肠道微生物组对摄入的益生菌的反应是否依赖于GOS补充。为此，基于物种水平分类谱的Bray– Curtis距离（图2a）对土著肠道微生物组β多样性的时间变化进行了定量。

益生菌的摄入自发地导致粪菌α多样性增加（图2c），并随着时间的推移在土著微生物群落结构中引起了剧烈的扰动，这与对照组的Bray– Curtis距离很明显（图2b，c）。相反，在连续补充GOS之后，在GPC组中观察到了肠道微生物组随时间的相对较高的稳定性（图2b，c）。间断的GOS补充增加了益生菌引起的波动。该结果表明，仅持续补充益生元可以减少由于益生菌入侵而引起的微生物组不稳定性。我们进一步确定了每个组中每个时间点与对照组存在差异丰富的物种（图2d）。在所有益生菌治疗组中，我们发现随着时间的流逝GPC组中与对照组相比物种水平丰富度差异最少。这进一步显示了在连续GOS补充下相对一致的微生物组构型。

接下来，我们在每个组中构建一个共现网络，以识别土著微生物与摄入的益生菌之间的生态关系。正向连接代表互利共生，而负向连接代表对抗或竞争。 PRO组的网络显示（图2e，右图），益生菌与Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium animalis, Lactobacillus animalis, Lactobacillus pentosus和 Lactobacillus johnsonii正相关，而与拟杆菌属的菌种呈负相关。有趣的是，益生菌组中Lp082与拟杆菌属之间的负相关在GPC组中变为正相关（图2e，左图）。共生网络是基于微生物丰度的动态构建的。持续的GOS补充不仅改善了土著肠道微生物群落中摄入益生菌的定殖，而且还促进了土著拟杆菌属物种（例如Bacteroidescaccae, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus, Bacteroides thetaiotaomicron和 Bacteroides caecimuris）的生长。基于此观察结果，我们得出结论，拟杆菌属菌种能够利用GOS，由于类似的碳水化合物利用状况，导致Lp082与拟杆菌属物种之间的激烈竞争。

图2 土著肠道微生物组在分类学水平上对益生菌摄入的反应。（a）基于每组粪便样本种水平分类谱的Bray-Curtis距离度量的PCoA图。不同颜色的点表示不同组中的样本，相同颜色的渐变表示同一组但时间点不同的样本。（b）在每个时间点，对照组和每个治疗组的样本之间的Bray-Curtis距离，误差线：平均值±SD。（c）在每个时间点与对照组相比的分类学香农多样性的变化，误差线：平均值±SD。（d）热图显示每组中与对照相比物种水平的分类单元发生了显着变化。（e）共现网络表明每种处理下Lp082与土著肠道物种之间的生态关系。群落成员用不同颜色的结节代表，即Lp082，与益生菌呈正相关，而与益生菌呈负相关。边缘根据一对节点之间相关性的符号和强度着色，这些符号和强度基于Spearman相关系数计。

3 持续的低聚半乳糖摄入会出现土著微生物组中碳水化合物活性酶（CAZymes）的变化

为了检查GOS的补充对土著粪便微生物组功能多样性的影响，我们使用益生菌治疗后所有组的Bray-Curtis距离度量来表征肠道微生物CAZymes多样性的时间变化。和对照组Bray–Curtis的距离明显证明了不同的益生菌给药对粪便CAZyme谱的普遍破坏（图3a，b）。在最初的两周中，在每个经过益生菌治疗的组中，粪便微生物群中CAZymes的Bray-Curtis距离持续增加，这可能是由于新的外源细菌引入了微生物组。有趣的是，在连续补充GOS的情况下，观察到的CAZyme分布图与对照组之间的Bray-Curtis距离比其他治疗方法小。结果表明，在连续GOS补充下的头2周内，肠道微生物组的CAZyme图谱与对照组的相似。益生菌定植2周后，发现所有益生菌处理下的CAZyme曲线都朝着类似对照组的构型转变。然后在每个时间点确定了治疗组之间差异丰富的CAZyme（图3c）。与对照组相比，GPC，GPP和PRO组中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-木糖苷酶的相对丰度急剧下降。

在三个益生菌给药组中，α-半乳糖苷酶，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖内切酶，α-L-鼠李糖苷酶，α-甘露糖苷酶和β-1,4-木聚糖酶的丰度显着增加。值得注意的是，GPC组中β-半乳糖苷酶的含量很高（图3c）。因此，我们得出结论，补充益生菌和GOS会导致土著肠道微生物群中某些关键CAZyme的过量表达，从而改善了与GOS利用相关的整体功能能力。

图3 益生菌与益生元共同摄入的特征是土著肠道微生物组的CAZymes随时间变化。（a）基于每组粪便微生物群中CAZymes图谱的Bray-Curtis距离的PCoA图。这些点由不同的治疗组着色。（b）基于每个时间点对照组和其他组之间CAZymes曲线的Bray-Curtis距离，误差线：平均值±SD。（c）对照组和其他经益生菌处理的组（GPC，GPP和PRO）之间显着的CAZymes变化，误差线：平均值±SD。

 

4 持续的低聚半乳糖摄入并未减少由益生菌摄入导致的土著肠道微生物组的适应性突变

之后，我们研究了在摄入益生菌过程中补充GOS对土著肠道菌群的单核苷酸变异（SNV）频率的影响。对于SNV分析，分析了至少95％的宏基因组学样本中具有足够覆盖率的16个物种。出乎意料的是，与对照相比，在经益生菌治疗的组中鉴定出793个推定的SNP，这表明施用益生菌显着增加了本地微生物组的总体突变。从基于SNV频率表的PCA图中，观察到益生元补充与SNV分布的关联较小（图4a）。与时间有关的SNV差异更为明显（图4b）。所有组中土著微生物的SNV频率在开始的两周内一直增加，在摄入益生菌2周后达到稳定水平或略有降低（图4a-b）。该结果表明，补充GOS并未减少益生菌摄入后土著肠道微生物组内遗传多样性的总体变化。

值得注意的是，在总共鉴定出的793个SNP中，绝大多数（超过90％）位于拟杆菌属物种中（如Bacteroides ovatus, Bacteroides caecimuris和Bacteroides thetaiotaomicron）（图4c，d），这是人类肠道中最丰富和普遍的物种。适应性进化下的基因主要参与碳水化合物利用和跨膜多糖输入，例如转座酶，整合酶，碳水化合物活性酶，结合转座子蛋白，SusC / SusD外膜蛋白和用于质粒转移的动员蛋白。有趣的是，即使持续补充GOS改变了土著拟杆菌和摄入益生菌之间的竞争关系（图2e），但它们仍然在同一肠道生态系统中频繁出现适应性突变。这表明，益生菌摄入介导的肠道微生物组进化过程比通常所认为的更快，复杂和深刻。

图4 GOS补充剂并未减少土著肠道微生物组内由补充益生菌导致的的适应性突变。（a）基于每个组中SNP欧式距离的PCoA图。这些点通过不同的处理方式着色。（b）基于每个时间点对照组与其他组SNP的欧式距离，误差线：平均值±SD。（c）热图显示了在每个时间点经益生菌处理的组（GPC，GPP和PRO）中每个物种中鉴定出的SNP的中位数。（d）拟杆菌和拟杆菌的基因组中已鉴定的SNP分布。

结果

健康人的肠道微生物群长期稳定，其中拟杆菌属和放线菌属可以存活5年。相反，与健康个体相比，炎性肠病和急性髓细胞性白血病患者中人肠道微生物组的时间变化更为频繁和极端。在患有急性髓性白血病的患者中还观察到粪便和口腔微生物多样性的高度时间不稳定。通常发现，益生菌在食用初期会引起轻度腹泻。此类事件可能与土著肠道菌群对摄入益生菌的抗性导致的肠道微生物组暂时不稳定有关。在本文中，我们强调了使用GOS的好处，发现它不仅促进了益生菌的生长，而且还缓冲了土著肠道微生物组对益生菌入侵的可能有害反应。因此，这保持了土著微生物组的稳定性并减少了益生菌摄入的副作用。

已经发现益生元可以促进益生菌的生长，但是其对肠道微生物组稳定性的影响仍然未知。我们的研究从进化论和生态学的角度着眼于益生元摄入对益生菌和益生菌摄入后土著肠道微生物时间稳定性的影响。胃肠道是居住微生物的战场，土著微生物和侵入性微生物都在其中争夺有限的养分，例如碳水化合物和空间。通过我们的微生物共生网络分析，我们发现，如果不提供益生元，则拟杆菌属物种与植物乳杆菌有很强的负相关性，这表明它们是天然存在的，强烈的拮抗关系。基因组测序表明，植物乳杆菌和拟杆菌属物种（包括卵形拟杆菌，寻常形拟杆菌，盲肠拟杆菌和茶生拟杆菌）都编码大量的β-半乳糖苷酶。这表明它们彼此具有相似的碳水化合物利用能力和生态位，这支持了强的负相关性观察。的确，饮食中的GOS可以在肠道中丰富包括乳糖杆菌在内的乳糖发酵细菌，以及某些拟杆菌的生长。巧合的是，益生菌和连续GOS的双重补充最终改变了它们的生态关系。因此，适当的益生元联合益生菌补充可以减弱外源益生菌与土著肠道微生物组之间的竞争性相互作用。

摄入的益生菌大量流入肠道，随后与土著微生物组竞争，导致肠道微生物组的不稳定性增加。我们观察到，外源性益生元碳水化合物减少了益生菌入侵土著肠道微生物组的群落组成而引起的有害变化。肠道微生物CAZymes也对营养素的增加提供了响应。有趣的是，尽管低聚半乳糖的摄入减少了益生菌和土著微生物组之间激烈的竞争，但在整个研究过程中，双方基因组内的适应性进化仍然非常活跃。这些推测的进化变化中有90％以上是在益生菌Lp082的土著微生物竞争者中发现的，这很可能增强了它们在肠道中的竞争能力和适应性。这强烈表明在相对较短的时间范围内，时常甚至每日补充益生菌可以迅速成为土著肠道微生物组生态和进化的强大驱动力，而这一点在很大程度上已被忽略。

总的来说，我们的研究阐明了益生菌摄入对整体肠道微生物组稳定性的影响，并强调了GOS介导的摄入益生菌与本地肠道微生物组之间的共同进化。这些发现提供了关于在肠道中合并补充益生元和益生菌的有益作用的新颖见解。

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