【疫苗简史】新冠病毒变异导致疫苗失效怎么办？流感疫苗的经验值得借鉴
自从2020年下半年以来，就已经有多种新冠变异病毒开始在全世界流行。目前看来，对于其中某些变异病毒，现有新冠疫苗的有效性受到一定影响，有所降低。比如最早在南非发现的B.1.351突变株。这种病毒在刺突蛋白（S）的受体结合区域出现了几个关键突变，显著改变了自己的“外观”，从而使病毒逃逸了人体免疫系统的识别。
近期发表的数据表明，英国牛津大学和阿斯利康公司合作开发的腺病毒载体疫苗对南非突变株B.1.351的预防能力从接近80%骤降到10%。Novavax公司开发的重组蛋白疫苗，对南非突变株的保护作用从原本的90%下降到了50%。
那如果新冠疫苗继续变异，变得使得现有疫苗都不再具有保护作用了，我们该如何应对？其实早在70多年前，科学家们早已经面对同样的难题，只不过主角不是新冠，而是流感病毒。今天我们就一起来了解下人类是怎么对待这个难题的？
流感的前病毒时代
在古代文明中很可能就已经存在流行性感冒，这可能是由于早期人类与驯养的动物宿主近距离接触所致。随着城市化进程的发展，从16世纪到19世纪，与流感的典型临床描述相一致的急性呼吸道疾病流行变得越来越频繁。
流感在整个历史上除了表现为反复频繁的季节性流感之外，还会以大流行形式定期肆虐人间。尽管流感大流行很可能在20世纪之前发生，但由于它们的发生早于现代微生物学和免疫学时代，因此这些报告的科学数据很少。
1889-90年的“俄罗斯流感”流行遍及了整个欧洲
1889年至1890年的流感大流行已经很严重，流行病史学家认为可能预示了1918年的大流行。1918年的流感大流行正巧发生在第一次世界大战这一背景下，导致了人类历史上前所未有的流行病传播速度和破坏规模的发生。在不到一年的时间里，全球有超过5000万人死于流感。
1918年的西班牙大流感是历史上感染人数最多，病死人数最多的一次流感大流行
尽管存在争议，但二十世纪初期的一个普遍假设是，流感是由细菌引起的。1892年，德国细菌学家理查德·菲佛（Richard Pfeiffer）在罗伯特·科赫（Robert Koch）的引领下，从感染患者的鼻腔分泌物中分离出一种细菌，并且以其名字命名为菲佛杆菌。由于当时科赫在学术圈的地位至高无上，所以此后数十年里，这种细菌一直被多数人公认为是引起人类流感的病原体。
理查德·菲佛曾以为自己发现了导致流感的病原体
当然，一直也会有不同的声音出现，一些科学家发现在很多流感死亡者的体内并不能分离培养到菲佛杆菌，但这些反对者也始终不能说清楚到底是什么引起了流感。
分离鉴定流感病毒
一直到1931年，1918年大流行发生后的13年，美国的病毒学家理查德·肖普（Richard Shope）（1901-1966年）从哺乳动物宿主中分离到了流感病毒。这份病毒取材于肖普1928年在爱荷华州调查猪霍乱流行时从猪体内获得的一份标本。肖普在普林斯顿的实验室中，通过向鼻内滴入呼吸道分泌物（分离自有或没有感染猪的肺和淋巴结组织的悬浮液）在健康猪中诱发了猪流感的临床综合征。研究进一步还证明了病原体可以在动物连续传代过程中维持。
肖普发现流感的病原体时，西班牙流感已经发生13年
1933年，英国国家医学研究所的克里斯托弗·安德鲁斯、威尔逊·史密斯和帕特里克·莱德劳报道了使用肖普的方法从人类感染者的喉咙冲洗液中分离出一种病毒。紧随英国科学家的发现，来自其他多个大洲的研究人员也得出了证实性的结果。
在对于流感病毒有了基本认识的基础上，实验室病毒培养技术的发展为开发针对流感病毒的疫苗铺平了道路。在1930年代初，古德帕斯丘报告在鸡胚的绒毛膜囊中成功培养了鸡痘病毒和牛痘病毒。
澳大利亚医师弗兰克·麦克法兰·伯内特（Sir Frank Macfarlane Burnet）曾在英国国家医学研究所的安德鲁斯实验室工作，回到墨尔本的实验室后，伯内特开始研究流行性感冒，并于1940年成功地在鸡胚的尿绒毛膜囊中培养出了甲型流感病毒。在鸡胚中培养流感病毒有助于对其生物学进行研究，并使其有可能产生大量病毒以用于诊断分析和疫苗的开发。
澳大利亚的伯内特首先在鸡胚中成功培养流感病毒
接种了天花病毒的鸡胚尿绒毛囊膜腔
如果伯内特仅凭他在微生物学上的发现，他的职业生涯就足以令人羡慕。他为理解噬菌体和微生物遗传学、动物病毒、实验室微生物学、Q热以及流感病毒都做出了重要贡献。然而，在57岁时，他做出了一个重要的决定，将工作重点完全转移到免疫学上，这种先见之明的策略，导致他提出了克隆选择理论来正确解释抗体的多样性，并转向他因发现免疫耐受现象。为此伯内特于1960年与彼得·梅达瓦尔（Peter Medawar）分享了当年的诺贝尔生理学或医学奖。
对于流感病毒的深入认识
随着人类流感病毒病因学的深入研究，一系列关于流感的重要发现将对后世产生重要影响。
洛克菲勒研究所的托马斯·弗朗西斯（Thomas Francis Jr）研发了血清中和抗体的检测及其在动物中作为诊断性测定和保护性标记物的用途；并且鉴定到与1933年分离到的流感抗原性不同的乙型流感病毒，而将1933年分离到的就被称之为甲型流感病毒。
法朗西斯研发了血清中和抗体检测，鉴定分离了乙型流感
乔治·赫斯特（George Hirst）认识到流感病毒会诱导红细胞凝集，这一发现导致了科学家对流感病毒表面蛋白血凝素（H）和神经氨酸酶（N）的认识，而两种蛋白为此后在体外和体内研究流感病毒提供了可检测的标记物，从而使人们更全面地了解了病原体的生物学行为。
赫斯特首先发现了流感病毒会诱导红细胞凝集的现象
红细胞凝集试验可以快速对流感病毒进行表型鉴定
流感病毒的结构示意图，可以看到表面分布了两种糖蛋白结构，分别是神经氨酸酶（N）和血凝素（H）
事实证明，识别流感病毒的抗原变异现象是一项重大进展，因为它阐明了流行为何会反复发生，并且也成为大流行发生的生物学基础，同时也对此后疫苗的开发提供了重要提示。
两种病毒表面蛋白的遗传突变是抗原漂移和抗原转换现象的基础。
抗原漂移是指，编码H和N糖蛋白的基因内的点突变会随时间累积，从而使病毒与以前的病毒株发生足够的差异，从而逃避了人类免疫系统的保护性保护。这些相对较小的差异导致了季节性流感的不定期流行。
抗原转换的过程涉及表面糖蛋白的主要遗传变异，这是由于禽类和人类病毒之间的重配或动物流感病毒直接转移给人类而导致的基因片段的替换所致。抗原转换导致从免疫识别的层面上其实是产生了一种新型病毒，并有可能导致大流行性疾病。
抗原转换（左）和抗原漂移（右）的比较
可以发现抗原转换完全是基因重组，而漂移只是小突变
灭活流感疫苗初战告捷
在1941年12月珍珠港事件促使美国正式参战之前，军事人员就已经担心大流行性流感可能会随着战争中涉及的大规模部队调动一起重新出现。毕竟，1918年的最新灾难性全球暴发与战争密不可分。美国于1941年成立了专门的科学咨询机构来应对这种疾病-陆军流感和其他流行病调查与控制委员会。
第一届陆军流感和其他流行病调查与控制委员会成员合影
其中包含多名研究流感和肺炎的著名科学家和医生
流感委员会是1941年成立的这个委员会的分支，其首任主任是托马斯·弗朗西斯（Thomas Francis Jr.）（1900-1969）。法兰西斯就是之前我们提到的那位先前在洛克菲勒研究所分离到乙型流感病毒，还发现了抗原性不同的流感亚型，并进行了早期疫苗工作的科学家。在他的领导下，流感委员会主要目标就是开发筛选出流感的保护性疫苗。
1940年代初的研究已经发现福尔马林灭活的流感疫苗不仅显示出免疫原性，而且还显示出比对照组明显更高的局部和全身反应率。但是尚未进行大规模的临床研究。
1943年10月，在康奈尔大学陆军学生训练计划的人员和全国其他军事机构的人员中进行了一项疫苗保护力的研究。碰巧的是，该项研究开始时也正好伴随着那个冬季大规模流感暴发。因此，委员会建议军队中进行大规模疫苗接种。在12474名受试者中，一半接种了灭活的二价甲型和乙型流感病毒疫苗，其有效性约为69％。
在接种疫苗的人群中有140例流感感染病例。这些病例的原因似乎是多因素的，其中包括在某些接种疫苗的受试者中血清反应较低，以及在某些地区相对于流感的早期出现而言，疫苗接种晚了。总体而言疫苗耐受良好。
在接下来的18个月中，对二价灭活流感疫苗进行了各种技术改造，最终在1945年末开始在美国陆军内部进行大规模接种免疫。由于研究过程中没有出现乙型流感的流行，因此没有能够评估乙型流感的发病率。在此期间，观察到该疫苗可保护经过免疫的陆军人员，但不能保护未接种疫苗的海军人员。
流感病毒变异初现
到1940年代后期，具有不同生物学和免疫学行为的甲型流感病毒变种正变得越来越多见，最初被称为“ A-prime”，可以理解为加强版的甲型流感病毒。
随着对流感知识的积累以及伴随着20世纪中叶现代病毒学的逐渐成熟，科学家们逐渐明确“ A-prime”变异株其实就是1918年流感病毒株的抗原漂移变体。H1N1亚型名称用于描述其表面糖蛋白的特定抗原构型。根据回顾性血清学分型，科学家认识造成1918年流感全球大流行的具有H1N1构型。
1918年大流行的之所以产生了如此大的伤害，根本原因也逐渐揭开了面纱：当时，该病毒代表一种新型的流感抗原形式，和之前流行的病毒相比已经出现了了抗原转换，并且由于全球的人类对于该病毒都没有暴露过，因此病毒高度易感感染。
从图可以看到流感的宿主多种多样，而不断进行重组就可能产生新的病毒株，有的高致病，有的高传染，最恐怖的就是两者兼有
1946年至1947年暴发的甲型流感变异株感染也是由H1N1型病毒引起的，但却是与原代病毒株在抗原上不同的变体，使得免疫只能提供部分的识别——虽然这足以产生交叉保护作用来避免大流行，但却使得疫苗接种无效。
每次大流行都与变异相关
1957年以新出现的“亚洲流感”为标志，这种流行病可能起源于中国西南部，并迅速传播到整个亚洲，并在3个月内到达北美。这是与现代实验室技术进行病毒学分析相结合的第一个流感大流行，并显示是由H2N2亚型病毒引起的，这是自1889年至1890年大流行以来尚未在人类中出现流行传播的抗原变异体。
1957年美国纽约州的一份当地报纸头版，可以看到流感流行已经促使公众开始接种疫苗
由于该病毒再次是抗原转换的结果，因此人群的免疫力很低，那些曾经从之前几次流行中幸存下来的人群也是如此。因此，发病率和死亡率都很高。
1968年的“香港流感”大流行也遇到了类似的情况，这是由于存在一种新型的H3N2亚型。但由于1957年株的神经氨酸酶抗原（N2）型的持续存在，使得人群中存在一定程度的部分免疫。
流感病毒基因组及其伴随的抗原漂移的变异性，使得每年必须重新评估和重新制定流感疫苗，以大概预测下一个流行季会流行的病毒抗原。
1972年，虽然当年的流感疫苗采用了1968年的H3N2“香港流感”株来制造疫苗，然而由于病毒看似不严重的变异依旧引起了疾病的暴发。这不得不让人们认识到，即使包含相似亚型异源病毒株的灭活疫苗，依旧可能会使得疫苗的有效性大打折扣。
在一项具有一定疗效的对照试验中也证明了这一点，如果发生变异，疫苗与病毒不匹配，其效果可能与安慰剂无差异，与匹配良好的疫苗产生的86％保护力水平会有显着差异。
甲流变种的出现损害了灭活疫苗的有效性。尽管科学家们一开始对流感病毒株之间的这种变异或抗原漂移尚不完全了解，但在接下来的二十年中坚持不懈地研究，逐渐使人们理解了这种变异的原理和意义，并导致疫苗配方的改变，以优化疫苗抗原与当前正在流行的流感病毒之间的相关性，最终使得疫苗效力再次提高。
灭活流感疫苗的致命弱点
自1997年以来在亚洲流行的新型禽流感变种和自2009年初以来在全球人类中传播的新型H1N1病毒再次引起了全世界的担忧。
在1940年代中期推出的灭活疫苗仍然是季节性流行性流感预防的主要手段。流感疫苗在很大程度上只能提供对与疫苗制剂中所包括的病毒株或与同源亚型的病毒株紧密匹配的病毒株的充分保护。但是，每当出现新的变种，流感疫苗就也必须随之需要改进，以提供增强的保护以抵抗包括大流行性流感在内的各种流感病毒株。
灭活疫苗的致命弱点仍然是对变种或漂移病毒株的保护作用不一致。对此，科学家们已经采取了各种措施来提高抗原性的水平和广度。
此外，由于疫苗涉及到鸡蛋有关的生产问题，因此灭活疫苗不被视为快速，有效地大规模应对可能构成大流行威胁的潜在新型病毒的灵活平台。
如何增强流感疫苗的保护效能
为了使现有的灭活疫苗在不断变异的流感病毒面前依然有效，全球的科学家和传染病专家不得不利用现有技术来尝试改进疫苗。
1. 流感监测网络：全球范围内的流感监测系统为早期发现新的流感病毒株可能会提供机会，并根据这些新出现的潜在威胁来配制疫苗。
2.添加佐剂增强免疫反应：1940年代中期，乔纳斯·索尔克（Jonas Salk）开始使用佐剂来提高免疫学性能。他在与脊髓灰质炎具有里程碑意义的工作之前的几年中，继续进行了这一研究，证明了这些免疫增强剂对疫苗接种后抗体滴度的大小和持续时间以及对异源病毒株的体液免疫广度的有利影响。
3.包含重组病毒，提高免疫原性：在当前的灭活疫苗中使用包含人类野生型，当代流感分离株的基因重组的高配，实验室操作株的重组病毒，可以提高免疫原性。
4.使用裂解技术，充分释放抗原：现代灭活疫苗中的病毒株通常在纯化后用有机溶剂或去污剂处理，以释放表面糖蛋白。这些裂解疫苗的不良反应发生较低，尤其是在儿童中。但也有研究表明，在从未接种流感疫苗的受试者中，其免疫原性却比全病毒灭活疫苗要低。
目前我国生产的流感疫苗均为裂解疫苗
5.尝试亚单位疫苗技术：当前的亚单位疫苗由富集的H和N抗原组成，同样，比灭活疫苗的不良反应会更少一些。通常，裂解或亚单位疫苗对具有相似抗原特性的病毒具有60-90％的保护性。
回过头，再试试减毒活疫苗
虽然在技术上进行了改进，但无法改变的是灭活的流感疫苗诱导粘膜和细胞介导的免疫相对较弱，并且由于它们对漂变变体的交叉保护不可靠，因此必须每年重新配制疫苗以提供的最佳保护，而人类也必须每年接种流感疫苗，以保证体内的抗体滴度，以及能够对最新流行的流感病毒株产生免疫力。
从早期开始，研究人员就开始倾向于使用活病毒可能产生广泛的免疫力。伯内特早在1940年代初成功将流感病毒在鸡胚尿囊膜传代后，就提出了一种减毒活疫苗方法，但是由于流感委员会支持下开发的灭活疫苗的出现，他就放弃了这一策略。
由于无法开发出可靠，有效的减毒方法，导致对流感病毒减毒活疫苗的研究速度减缓了数年之久。可以被当做疫苗的稳定减毒活病毒必须能够感染呼吸道并刺激细胞和体液免疫又不会引起人类疾病。
经过各种减毒方法的实验后，证明冷适应株是最佳的方法。甲型和乙型流感病毒在25°C下在组织培养和卵中的连续传代会在病毒基因中引入点突变，从而导致冷适应。对温度敏感的减毒病毒株，然后在实验室中将其与预计在特定季节会在社区人群中传播的病毒株进行重组。这种减毒活疫苗以与自然流感感染相似的方式经鼻内给药，可诱导细胞和体液免疫，包括粘膜反应，并已证明对儿童具有很高的保护效力。
另外，有证据表明，至少在儿童中，与灭活疫苗相比，它可能更可靠，更有效，并能以更大的程度上抵抗抗原性漂移变体。
期待更完美的流感疫苗
由于H1N1和H3N2甲型流感亚型的变体仍然是全世界流行性人类感染的主要原因，因此，目前的疫苗为包含这些基本基因型的代表，以及预计会在下一场流感季节中传播的1种或2种乙型流感病毒共同组成。如果是2种甲流+2种乙流病毒株，便组成了四价流感疫苗，如果是2种甲流+1种乙流病毒株，便是三价流感疫苗。无论是四价还是三价流感疫苗，都是世界卫生组织推荐的流感疫苗品种。除非当年正好流行的是四价覆盖而三价没有覆盖的病毒株，否则两种疫苗保护效果并没有太大差别。
但是从中可以发现疫苗的配制和生产过程是劳动密集型的，要耗费时间，并且这种预测伴随着固有的风险水平；在过去的几年中，疫苗与实际社区传播的病毒不匹配，导致了流感发病率和死亡率的突然升高。减毒活疫苗也并未从实质性地改变上述基本过程，这使得当前可用的流感疫苗在保护大流行方面都不是最理想的平台。
因此，流感疫苗还不完美，历史有待于后人的书写。针对流感病毒的疫苗预防的新方法正在开发中，将创新的分子技术应用于流感病毒特征性的抗原漂移和转换问题，以避免需要每年重新配制疫苗。
流行性感冒的终极目标应该是开发一款通用的、交叉保护的疫苗，该疫苗可在大流行期间和大流行期间针对所有病毒株使用。由于流感病毒具有固有的变异性，因此这种疫苗可能必须基于保守的抗原，并且可能还需要通过使用佐剂或其他方法增强免疫反应而得到增强。
新冠疫苗同样必须面对的难题
从流感疫苗开发的历史，我们可以发现，针对善变的流感病毒，现有的技术平台有点应接不暇。新冠病毒正在不断出现的变异病毒株也提示我们，人类不应该只满足于现有的平台技术开发疫苗。必须多种技术开发路线齐头并进，特别是寻找更新的技术平台，以期望能够克服现有疫苗的不足，做到“你变我也变，你快我更快”。
当然，超过半个世纪的流感疫苗开发历史也告诉我们，找到一种新的成熟技术并不容易，但与流感不同的是，此次新冠病毒全球大流行得以让全世界相关领域最顶尖的科学家和风险资本都汇聚到疫苗的研发中来，各国政府也是鼎力支持，汇聚全人类之合力，相信在疫苗研制的征途中，一定会有新的突破，而带来的好处或许不只是局限在新冠疫苗，更有可能是整个疫苗产业的革新。
参考文献
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Honigsbaum M.（2013）A History of the Great Influenza Pandemics: Death, Panic and Hysteria, 1830-1920. I.B. Tauris
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http://en.wikipedia.org/wiki/Influenza_vaccine