密码子优化需要考虑哪些因素？

密码子优化需要综合考虑多种因素，才能取得良好的优化效果。不是简单地将外源基因的同义密码子调整为宿主细胞中表达丰度高、使用频率高的密码子就能提高蛋白的翻译效率，有时候效果往往会适得其反。因此密码子优化并不是一个简单的实验。下面我们介绍密码子优化时需要注意的主要因素：

1. 用宿主中最相似频率的同义密码子替换原序列密码子。如上述所言，生物体翻译过程中存在密码子的偏好性，若是在基因的同义密码子使用频率与表达宿主相匹配的情况下，蛋白的表达水平则会显著提高。匹配程度常用密码子适应指数 （Codon Adaption Index，CAI）来表示，通常情况下，CAI≥0.80被认为是预测重组蛋白高效表达的标准。并且在设计时要避免连续两个以上稀有密码子同时存在，否则很可能会导致翻译效率急剧降低，甚至可能会终止肽链的合成。

2. mRNA二级结构。mRNA的二级结构对翻译效率具有一定的影响。当mRNA因其序列而形成复杂稳定的二级结构时，会降低翻译效率。尤其是序列里有和核糖体结合位点或翻译起始位点互作的序列，会阻止翻译的进行，合理优化翻译起始区的mRNA二级结构，将有效提高目的蛋白表达水平。

3. 避开某些限制性酶切位点。在密码子优化时避免形成构建载体时所需要的酶切位点，以免酶切位点产生冲突，影响构建表达载体的操作。

4. GC含量要合适。GC含量能影响DNA的稳定性，间接影响基因的表达调控，当GC含量超过70%可能会降低蛋白的表达。

5. 调整Motif和剪切位点。如增强子、Shine-Dalgarno序列的特异核糖体结合序列、TATA box等顺式作用原件能促进或者抑制基因的表达量。因此调整相关Motif能提高蛋白的表达量。而去除内含子属性的剪接位点，也能提高蛋白表达成功率。