广谱抗白粉病基因mlo

大麦mlo(Mildew resistance locus o)基因是Mlo功能缺失(loss-of-function)突变，对白粉病抗性具有负调控作用，介导了大麦对白粉病的广谱和持久抗性。不同于专化抗性的R基因，大麦mlo基因介导的抗性具有显著特点：1) mlo是隐性抗病基因；2) 对白粉病具有广谱抗性，几乎对目前已知的所有白粉菌生理小种都具有抗性；3) 可通过诱变野生型(Mlo)品种产生抗病的突变型(mlo)；4) mlo具有持久抗性；5)在病原菌侵染情况下，mlo植株表现自发的细胞壁加固和叶片坏死(Jørgensen et al., 1992)。

大麦mlo隐性突变基因的发现

对大麦进行人工诱变产生白粉病抗性最早可追溯到20世纪40年代。Freisleben et al. (1942)利用X射线处理德国大麦品种Haisa，发现突变体M66具有白粉病抗性，而且其白粉病抗性总是与叶衰或叶片坏死连锁。随后科学家们通过X射线或EMS诱变的方法获得了多个与M66表型相似的大麦抗白粉病突变体。Lau等(1962)通过遗传分析发现M66对白粉病的抗性由隐性单基因控制。从20世纪40年代到70年代，mlo均是通过人工诱变方法获得，未发现自然突变类型。Jørgensen et al. (1983)对10个与M66表型相似的突变体进行了分析，发现它们所含的抗病基因位于同一基因座位，10个等位基因被命名为mlo1-mlo10，其中M66中的mlo基因被命名为mlo-1。Jørgensen et al. (1983)在埃塞俄比亚大麦品种Grannenlose Zweizeilige中发现了自发突变的mlo等位基因，后被命名为mlo-11。目前大麦中mlo等位基因已经超过40个(Reinstädler et al., 2010)。Mlo基因不仅存在于禾本科植物中，Consonni et al. (2006)发现Mlo基因在双子叶模式植物拟南芥中同样保守，通过对AtMlo纯合子插入突变体接种白粉菌后发现同样具有白粉病抗性。此后相继在其它多种高等植物，如苹果、葡萄、黄瓜、豌豆、辣椒、玫瑰、草莓、烟草和番茄等物种中发现了Mlo的同源基因，其突变型同样具有白粉病抗性(Kusch & Panstruga, 2017)。

图1 mlo在多种植物中具有抗白粉病功能(Kusch & Panstruga, 2017)

大麦mlo基因定位与克隆

Jørgensen et al. (1984，1987)最早报道了mlo染色体定位，将其定位到大麦4H染色体长臂。德国马克斯普朗克植物育种研究所(Max Planck Institute for Plant Breeding Research)的Hinze et al. (1991)首次利用RFLP分子标记对mlo进行了定位。他们首先利用8个mlo BC₇近等基因系和供体亲本Ingrid筛选RFLP标记，然后利用大麦品种Spontaneum和Aramir构建的147个F₂群体对多态性的RFLP标记进行了定位，构建了大麦4H染色体RFLP标记遗传连锁图谱，最后利用大麦品种Carlsberg II(Mlo)和G.Zweiz(mlo-11)构建的F₂群体，将Mlo基因定位在分子标记bAL88和bAO11之间2.4 cM的遗传区间。

1997年，英国John Innes Centre Sainsbury实验室和德国马克斯普朗克植物育种研究所合作图位克隆了mlo。他们在Hinze et al. (1991)工作基础上，利用大麦品种CarlsbergII(Mlo)和G. Zweiz(mlo-11)构建的包含70个单株的F₂群体筛选AFLP标记，构建了AFLP标记遗传连锁图谱，并利用mlo两侧AFLP标记筛选Ingrid(Mlo)和BC₇ Ingrid(mlo-3)构建的包含2,022个单株的F₂精细作图群体，将mlo基因定位到AFLP标记Bpm2(0.24 cM)和Bpm9(0.4 cM)之间0.64 cM的遗传区间，其中分子标记Bpm16与Mlo共分离。随后利用共分离的分子标记Bpm16为探针筛选了Ingred(Mlo)的YAC文库，筛选到4个YAC阳性克隆(YHV417-D1、YHV400-H11、YHV322-G2和YHV303-A6)。进一步分析发现其中3个YAC克隆(YHV400-H11、YHV322-G2和YHV303-A6)包含标记Bpm2和Bpm9位点，表明这3个克隆包含了Mlo物理位点。随后利用其中一个克隆YHV303-A6(650 kb)构建BAC文库，利用探针Bpm16继续筛选到阳性克隆BAC F15(60 kb)，该克隆包含了分子标记Bpm2和Bpm16位点，但不包含分子标记Bpm9位点。根据分子标记Bpm2和Bpm19之间的序列重新设计了AFLP标记筛选重组单株，最后将mlo定位到了分子标记Bpm2(0.24 cM)和Bxm2(0.1 cM)之间0.34 cM遗传区间，物理距离为30 kb。利用BAC F15上的限制性酶切位点进行序列酶切和contigs分析，最后筛选到1个长度为5.8 kb的contig，包含了分子标记Bpm16位点和一个高可信的编码框区域。经基因扩增和序列分析发现，该基因只有1种开放阅读框，长度为1,599 bp，编码了包含533个氨基酸(60.4 kDa)的蛋白。分析DNA序列后发现该基因包含12个外显子和11个内含子，其中分子标记Bpm16横跨了第11个内含子和第12个外显子。mlo基因不同于以往克隆的R基因，是一种新类型的抗病基因，编码具有7个跨膜螺旋(7-TM)的跨膜蛋白。
   利用突变体测序的方法对mlo基因进行功能验证。通过对已知的11个mlo突变体进行测序发现，11个突变体(来自6个不同的遗传背景)都在mlo位点发生了SNP突变或缺失，并能引起氨基酸变异。同时还利用mlo两个不同位点突变体遗传重组的方法对mlo进行了功能验证：突变体mlo-5和mlo-8的突变发生在同一位点，都在mlo基因第1个外显子；而突变体mlo-1的突变发生在mlo基因第4个外显子，两个突变体突变位点距离820 bp。利用mlo-5和mlo-8分别与mlo-1杂交，杂种F₁代自交获得F₂分离群体进行白粉病抗性鉴定，最后在mlo-8×mlo-1组合的F₂群体鉴定到3株感病单株，mlo-5×mlo-1组合中鉴定到9株感病单株。通过对感病重组单株遗传分析、测序和Southern blot分析，明确了发现的感病单株都是重组的Mlo基因型，进一步对mlo进行了功能验证(Büschges et al., 1997)。

图2 mlo图位克隆(Büschges et al., 1997)

mlo基因介导的大麦白粉病抗性分子机理研究

Büschges et al. (1997)基于遗传实验数据，提出大麦Mlo蛋白在植物免疫中具有负调控作用。Devoto et al. (1999)利用N-糖基化突变扫描(Scanning N-glycosylation mutagenesis)、Mlo-Lep蛋白融合(Mlo-Lep fusion proteins)技术以及免疫印迹等技术对Mlo基因编码的蛋白进行了研究，证明了Mlo基因编码的是一种具有7个跨膜螺旋(7-TM)的膜锚定蛋白，其N-端位于细胞内，C-端位于细胞外(图3)。Mlo蛋白质拓扑结构以及细胞膜定位特点类似于动物和真菌G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors)。但Kim等(2002)等通过遗传和生化实验发现异源三聚体G蛋白亚基在Mlo蛋白功能或mlo基因介导的白粉病抗性中并没有作用。进一步通过筛选水稻cDNA酵母文库，发现钙调素蛋白(CaM)与Mlo蛋白可以互作。在大麦中，通过RNAi沉默CaM可以使大麦感病性明显降低，说明当CaM不与Mlo蛋白结合时，Mlo蛋白抑制植物防御反应的能力将被减弱，而大麦抗病能力将增强。研究指出Mlo蛋白是一类新型的钙调素(CaM)结合蛋白，在调节植物的防卫反应中起到了感应器的作用，调控植物细胞死亡和防御反应。

图3 Mlo蛋白家族的拓扑结构(Devoto et al. 1999)

大麦mlo基因通过参与调控细胞内乳突的形成，调节细胞壁的修复过程，负调控植物防御白粉菌侵染。Skou et al. (1984)研究发现大麦mlo基因介导的白粉病抗病表现在早期的亚细胞壁加固(Local cell-wall appositions，CWA)，即强烈的乳突反应，能阻止白粉菌的芽孢穿透宿主表皮细胞，进而妨碍了白粉菌菌丝生长和有性世代的形成，阻止侵染。近一步分析乳突化学成分发现，其中含有大量的胼胝质，纤维束、木质素、多酚类物质和过氧化物等。细胞学研究发现，在mlo介导的抗病反应中，病原菌的发育几乎都被限制在亚细胞结构中。mlo介导的抗病反应也伴随着叶枯或坏死斑点的产生，表明叶细胞程序性死亡在防御病原菌侵染mlo叶表皮细胞过程中发挥了重要作用。科学家们还开展了药理学方面的抗病机制，Bayles et al. (1990)发现外施DDG(glucoseanalog 2-deoxy-D-glucose)或甘露糖可以局部抑制mlo基因的抗性。Lyngkjar等(1997)进一步发现这些化合物可以影响乳突的发生和形成，进而影响胼胝质的合成和积累，最终影响白粉菌的抗性。

Freialdenhoven et al.(1996)最早开展了关于mlo抑制子(suppressor)的相关研究。他们通过EMS 诱变Ingrid背景下的mlo-5近等基因系，在M₂中发现了6个感病单株。进一步通过遗传实验证明这些感病单株都是不同于mlo基因位点的单基因隐性突变。这些突变体分为两个不同连锁位点，但对mlo介导的抗病反应都是必须的，后将其命名为Ror1和Ror2 (required for mlo-specified resistance)。Collins等(2001)最早利用AFLP和STS标记对Ror1进行了定位，利用3个遗传群体将Ror1基因定位在大麦1H染色体0.2-0.5 cM遗传区间。Acevedo-Garcia等(2013)进一步筛选大麦YAC文库，利用染色体步移的方法，最终将Ror1定位到大麦1H染色体长臂近着丝粒0.18 cM遗传区间。由于该区域近着丝粒，重组受到抑制，并且该区间与其他禾本科植物共线性差，最终阻碍了Ror1基因的定位克隆。相比于Ror1，Ror2克隆比较顺利，Collins et al. (2003)通过大麦和水稻的共线性关系，利用图位克隆的方法对Ror2进行了克隆，发现是一个编码t-SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白，与拟南芥PENETR ATION1(PEN1)同源。Ror2蛋白能够和一个SNARE(synaptosome-associated protein receptor)蛋白形成复合物，该复合物可能参与抗病反应中抗菌化合物的分泌。

最近，中国科学院遗传与发育生物学研究所杨维才研究组对Mlo在拟南芥中的同源基因功能进行了研究，发现在拟南芥中存在15个Mlo同源基因，其中3个同源基因Mlo5，Mlo9和Mlo15在花粉中高表达，其突变体mlo5/9和三突变体mlo5/9/15的花粉管在穿出花柱道后，表现为严重卷曲而不能进入胚囊，最终导致败育的现象。他们发现，在mlo5/9花粉管的胞质内Ca² 浓度降低，并且Ca² 通道蛋白CNGC18的膜定位明显消失；MLO5可与CNGC18互作，且伴随花粉管转弯，可以检测到MLO和CNGC18以及Ca2 向转弯方向的重新定位。进一步发现，MLO5/9/15通过VAMP721和VAMP722来调控CNGC18在质膜上局部的重新定位，进而影响花粉管转弯时局部胞质Ca² 浓度，来调控花粉管向胞外信号的定向响应的分子机制，解析了花粉管中MLO蛋白介导的胚囊信号和Ca² 之间的信号级联在花粉管导向中的分子机理(Meng et al., 2020)。

小麦Mlo直系同源基因研究

英国Jonh Innes Centre的Elliott et al. (2002)最早对小麦中Mlo的同源基因进行相关研究。他们首先利用普通小麦品种Opata85和一个人工合成小麦(Synthetic)构建的作图群体对Mlo同源基因进行了定位，将3个同源基因定位到小麦5A、4B和4D染色体长臂，与大麦mlo基因染色体位置对应。随后利用大麦mlo基因cDNA作探针筛选了小麦根系的cDNA文库，筛选到两个克隆，并对其中一个克隆TaMlo-B1进行了重点研究。他们利用GUS驱动瞬时转化方法将TaMlo-B1的cDNA转化突变型mlo-5大麦发现其可以互补Mlo表型，即感白粉病，而在大麦和小麦中过表达TaMlo-B1能使其对白粉菌侵染更加敏感，即更感病。Várallyay et al. (2012)通过VIGS技术对小麦中的Mlo同源基因进行沉默发现能够增强白粉病抗性。

2008年南京农业大学马正强团队在栽培一粒小麦(Triticum Monococcum L.)品系TA2026中鉴定出一个隐性抗白粉病基因pm2026。通过构建与感病品系M389构建遗传分离群体，将pm2026定位于5A^mL染色体臂末端SSR标记Xcfd39和Xgwm126之间，3个由RFLP探针转化来的STS标记MAG1491, MAG1493和MAG1494与pm2026连锁,其中Xmag1493与pm2026相距仅0.9 cM。另外一个与大麦Mlo基因同源的小麦cDNA序列开发的STS标记MAG2170与Xmag1493共分离(Xu et al., 2008)。从这些分子标记序列所在的中国春5AL基因组序列推测，pm2026可能是大麦mlo基因在小麦中的直系同源基因。

2014年中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞课题组和微生物研究所邱金龙课题组合作，首次利用基因组编辑技术对小麦中的3个Mlo同源基因同时进行了突变，获得了抗白粉病的小麦材料。该研究利用TALEN技术对小麦中Mlo基因的3个拷贝进行敲除，在T₀代转基因植株中检测到35个Mlo基因突变体，这些突变体包含单拷贝、双拷贝以及三拷贝的突变。对突变体后代分析发现，基因编辑产生的突变可以稳定遗传给后代，并符合孟德尔遗传规律。对纯合突变体接种，发现只有小麦A、B和D基因组上3个Mlo同源基因同时突变的纯合突变体才表现出对白粉菌极为显著的广谱抗性(Wang et al., 2014)。该研究为小麦中应用Mlo基因培育抗白粉病品种提供了全新的思路和技术路线。

Acevedo-Garcia et al. (2017)利用TILLING技术对小麦品种Cadenza的EMS突变体库进行TaMlo部分功能缺失等位基因筛选，最终筛选到16个突变体，这些突变体为发生在小麦TaMlo同源基因TaMlo-A1，TaMlo-B1和TaMlo-D1中的单一突变，每个突变都是单个SNP的替换。利用大麦单细胞瞬时转化实验对这16个突变体的白粉病抗性进行了评估，选取了其中抗性较好的突变体，利用遗传重组的方法最终得到4个纯合Tamlo基因3个拷贝突变家系，都表现出较好的白粉病抗性(图4)，为在小麦育种和生产上利用Tamlo非转基因材料培育抗白粉病小麦新品种提供了资源材料。

图4 小麦Tamlo三拷贝突变体的白粉病抗性(Acevedo-Garcia et al., 2017)

mlo基因的育种利用
  　mlo基因表现持久和广谱白粉病抗性，具有重要的育种潜力。大麦mlo突变体除了偶尔会在叶片上观察到少许的白粉病孢子外，往往或多或少地呈现叶片坏死、黄化和退绿斑等，尤其在抽穗期之后。mlo基因突变体叶片坏死等性状不是由于病原菌侵染导致的过敏性反应，而是其自身的负效应，但不同遗传背景下发生程度存在显著差异，部分品种仅有非常轻微的坏死反应。叶片坏死和退绿影响光合作用，mlo突变体往往粒重降低，产量下降(4%左右,Jørgensen 1992)。来源于埃塞俄比亚的mlo天然突变资源(mlo11)和新创制的突变体材料(mlo9)不良性状少，利用其进行遗传改良和背景选择，新育成的含有mlo基因抗白粉病大麦新品种已经没有明显的不良性状，产量水平可与高产商业品种相当，上世纪80-90年代之后在西欧得以大面积推广，占大麦播种面积的20-35%。

Acevedo-Garcia et al. (2017)利用Tilling方法创制的小麦Tamlo基因三拷贝突变体材料分别聚合了抗性程度不同的直系同源基因，以降低对农艺性状的影响，但其白粉病抗性水平稍弱于王延鹏等(Wang et al. 2014)利用TALEN技术创制的基因编辑材料，而且在株高和单株穗数上也存在一定程度的降低(图5b,c)。

图5 小麦Tamlo三拷贝突变体性状表现(Acevedo-Garcia et al., 2017)

　　高彩霞研究员课题组创制的个别Tamlo基因编辑三拷贝突变体也表现出叶片黄化(5a)，但有些品系(如R32)未观察到明显的不良农艺性状。我们将R32品系白粉病抗性导入高产品种遗传背景的过程中未发现明显的不良农艺性状，但具有优异的白粉病抗性(图6)。因此，利用基因组编辑或诱变创制大量的TaMlo基因不同类型突变体是育种应用Tamlo基因广谱白粉病抗性的有效途径。由于需要3个同源基因Tamlo-A1，Tamlo-B1和Tamlo-D1均发生突变才具有白粉病抗性，在常规杂交育种和回交转育中要同时对3个基因拷贝进行选择和聚合，需要较大的分离群体，并且借助于分子标记辅助选择提高选择效率。

图6 小麦Tamlo基因编辑突变体R32向高产品种农大2011的回交转育

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