一作解读|利用GWAS探究中国小麦种质芽期耐盐性的优异单倍型及其溯源分析
随着气候变化、土地退化和海水侵蚀等问题的不断发生，土壤盐渍化现象日益加重，业已成为危害小麦等粮食作物的生产安全的重要因素。此外，城市化发展侵占了大量的农业用地，为了保证粮食安全，对于一些具有种植潜力的边际土地如盐碱地等的利用日益受到重视。然而在现代小麦育种体系中，品种选育主要在高肥高水和最佳田间管理条件下进行。因此，评价中国当前小麦材料的耐盐性，挖掘耐盐优异单倍型，对于指导小麦耐盐特色化育种有重要的意义。
西北农林科技大学康振生课题组前期从全世界收集了5000余份小麦种质资源，并利用小麦660K SNP芯片对1500余份材料进行了基因型测定。利用上述材料，康振生/韩德俊课题组通过与中科院南京土壤所、山东大学、中国农科院等单位合作，选取307份具有遗传代表性的材料（包括中国的现代主栽品种、核心种质、地方农家种、不同历史时期释放的中国小麦代表性品种以及部分国外引进骨干亲本材料），进行了芽期耐盐性鉴定和该表型的全基因组关联分析（GWAS），并在我国老一辈科学家前期系统梳理的小麦系谱、亲缘关系的基础上，结合现代分子标记信息，对我国小麦种质耐盐性相关优异单倍型进行了溯源分析。上述成果以“Haplotype variations in QTL for salt tolerance in Chinese wheat accessions identified by marker-based and pedigree-based kinship analyses”为题，近期发表在国产卓越行动重点期刊《The Crop Journal》上，康振生院士和韩德俊教授为通讯作者，西北农林科技大学博士研究生余世洲、吴建辉博士和中科院南京土壤所王萌博士为并列第一作者。
研究内容：
（1）对307份材料的基因型数据进行了群体结构分析、主成分、系统树及连锁不平衡（LD）分析：结果表明307份材料划可分为7个亚群，分别命名为Sp1～Sp7，其中Sp1亚群的材料主要来自西亚/东非等小麦起源地，为古老农家种或栽培品种；Sp2亚群材料主要部分多为国外近70年的栽培品种；Sp3亚群主要为中国农家种；Sp4、Sp5和Sp6亚群包含了中国不同年代的品种，主要有早期通过中国农家种和国外引种杂交选育的品种以及国内历代主栽品种等，Sp7亚群主要为近二十年国内主栽品种。小麦全基因组LD衰减距离为3.2Mb，A亚组、B亚组和D亚组的LD衰减距离分别为2.7Mb、4.8 Mb 和2.0Mb。
图一：307份小麦群体结构及连锁不平衡分析
（2）提出了种子植物耐盐性量化评价方法：该方法的主要理论依据在其它环境条件不变的情况下，环境盐度在0至1标准盐度范围内，品种的发芽率、存活率或繁殖率变化曲线受品种的耐盐能力决定。根据可直接测量性状变化曲线，借鉴积分方法（如图一），消去盐度因素的影响，得到一个与品种耐盐成比例的一个常数，称为耐盐指数，记作。具体计算公式为：
研究将纯水的盐度定义为0，将约等于世界海水平均盐度35‰的人工海水溶液盐度定义为1。研究对具体试验操作中设备器材、种子预处理、数据计算等都做了具体规定，并完成了芽期的实例验证，证实了提出方法的可行性。
图二：小麦耐盐指数的计算示意图
图三：不同物种在不同盐浓度下的耐盐能力
（3）对307个小麦品种芽期耐盐性进行了鉴定：结果表明，各品种耐盐性指数趋于正态分布，数值范围为0.1257~0.9522，品种间耐盐性差异显著。在307个品种中，9个品种YANGMAI-2（扬麦2号）、YUMAI-2 (豫麦2号)、GAOYOU-2018 (藁优2018)、 MIANYANG-86-11 (绵阳-86-11)、 LAGEADINHO、ZAOSUI-30 (早穗30)、ROBADINHO、XIAOYAN-6(小偃6号)、 XIAOYAN-22(小偃22)的耐盐性指数在0.90以上，三个品种BENDIMAI（本地麦）、DUIKER和EARLY-PREMIUM（早洋麦）的耐盐性指数低于0.2。不同亚群之间也存在差异，整体上看现代种要优于农家种。我们对品种耐盐表型进行层级分类，整体分为两组，耐盐的表型组与不耐盐表型组之间的临界点为0.6（图5a,b）。
图四：不同品种耐盐指数的分布
图五：307份小麦品种的耐盐表型评价
（4）结合基因型和表型关联分析结果表明：和小麦芽期耐盐性相关的117个显著性位点（P<1×10-5）分布在9条染色体或Scaffold 上，其中有3条染色体1A、3B和6B拥有的候选位点数目最多，分别为73、15和20，解释了8.92%、5.23%和1.98%的表型变异（图六）。单倍型分析表明，用大小写表示优异/非优异单倍型，1A上有3种单倍型，即Hap-1A-1，Hap-1A-2，Hap-1a；3B上有两种，即Hap-3B和Hap-3b；6B上有两种，即Hap-6B和Hap-6b。且三者存在简单的加性效应，即含有优异位点越多，耐盐性越好（图七）。有意思的是，部分不含有上述优异单倍型的材料，也表现了优异的耐盐性，这些材料大部分为我国农家种或早期的农家种衍生的品种，它们在本群体中为稀有变异，值得进一步挖掘。三条染色体定位区间包括53个基因，包含了转录因子、钙调蛋白，抗氧化酶及渗透调节物质合成酶等，其中有35个基因在盐胁迫环境下，上调或者下调表达。其中位于1A目标区间的转录因子ABI5-like，在多个研究中表明其参与种子萌发，很可能是本研究中的一个重要候选基因。
图六：307份小麦的关联分析及单倍型鉴定
图七：不同单倍型组合及其耐盐性表现
（5）基于标记和系谱的亲缘分析表明，在中国杂交育种的早期阶段，有利的单倍型主要来自一些外来品种以及有限的中国农家种。其中Hap-1A-1和Hap-3B主要来源于国外品种郑引1号（St1472/506）、郑引4号（St2422/464）、矮粒多（Ardito）阿夫（Funo）和欧柔（Orofen）以及部分CIMMYT种质等，目前这些品种被广泛应用在中国品种中，其中它们衍生出来的比如部分扬麦系列、豫麦系列、周麦系列都具有Hap-1A-1 Hap-3B Hap-6B的单倍型组合；而最不利的单倍型组合Hap_1a 3b 6b主要来自碧玉麦和早洋麦及其衍生的部分品种如石家庄54、北京8号、济南9号等； Hap-1A-2主要来源国内农家种如燕大1817、鲫鱼麦、白火麦、三月黄、平原50、江东门以及农家种衍生的部分“晋麦”、“冀麦”系列（图八）。
图八：基于亲缘关系的耐盐单倍型追溯
（6）将三个QTL的等位基因频率放大到另外约1000份小麦材料中，发现分析群体（307份）和验证群体（999份）的频率基本一致，说明所挑选的307份材料充分代表了多样性。进一步，我们发现Hap-6B的频率最高（图九a），超过75%；另外，以1980年为界，Hap-1A-1频率不断变大，相反，Hap-1A-2的频率不断变小（图九b）。通过查阅文献以及比较不同单倍型组的籽粒性状发现，Hap-6B与控制籽粒大小的QTL是连锁的，且Hap-6B比6b的千粒重要重，同样，虽然未在1A上发现与Hap-1A-1连锁的籽粒性状位点，但Hap-1A-1比Hap-1A-2的千粒重要重。说明在长期人工对产量的选择中，通过基因搭载效应，被动地提高了部分耐盐单倍型的频率。
图九：各单倍型频率的变化
（7）在现代育种体系下，随着时间的推移产量不断提高，但耐盐性几乎没有变化，而遗传多样性始终是在下降。优异耐盐单倍型较为单一（这可能与我国的育种目标有关，很少有针对性的进行耐盐育种）。由于城镇化的加快，可耕地面积不断在缩小，一些科学家正在尝试如何利用一些干旱或盐碱等边际土地，而国家目前提出的环渤粮仓战略，正是出于这方面的考虑。对于小麦而言，需要有目标的进行耐盐育种，由于目前耐盐优异单倍型稀少，需扩大耐盐资源的收集鉴定。本研究中部分农家种表现出良好的耐盐性，并携带着尚未在育种中利用的稀有变异，因此耐盐育种可以重新考虑对国内农家种的利用。另外，诸如一些小麦近缘物种，也具有良好的耐盐碱特性，比如偃麦草；在本研究中，小偃6号及其衍生系，以及山融3号等偃麦草与小麦的杂交品种，都具有良好的耐盐能力。因此，未来可以加大对野生近缘物种的利用。可喜的是，我国有大批的小麦工作者长期致力于对近缘物种的探究，这势必为耐盐碱育种奠定坚实的材料基础。
后记：本研究是多个单位合作的结果，包括中国农科院贾继增研究员、山东大学夏光敏教授、中国科学院南京土壤研究所施卫明研究员等，都为本研究提供了帮助和指导。还要感谢小麦研究联盟这个平台，能认识很多年轻人，使我们能够一起做一些感兴趣的研究。同时，也非常感谢一些会议的举办（如小麦研究联盟-wheat omics第一届青年学术研讨会，中国农大稼穑论坛等），使我们在汇报过程中获得了众多前辈和同行提出的宝贵建议！
（本文作者合影：左-吴建辉博士；中-王萌博士；右-余世洲准博士）