CNAS中关于实验室分子诊断项目的性能验证方案
实验室常用的分子诊断技术包括：PCR、Sanger 测序、二代基因测序(NGS)、原位杂交等，鉴于实际临床工作中进行分子诊断的样本类型（如进行原位杂交的样本有血液、羊 水穿刺、肿瘤组织等）以及预期用途差别较大，而不同样本类型对性能验证的要求和难易程 度差别较大，建议结合实际情况酌情选择与之相符合的性能验证方案。
目前，实验室常规开展的分子诊断项目以PCR技术最为常用，PCR技术又分为PCR定量检测技术和PCR定性检测技术。本文依据CNAS整理出采用PCR技术的分子诊断项目宜参考的性能验证参数及方案。
一、PCR定性检测项目
（一）性能验证参数
1. PCR 定性检测选择验证的性能指标宜包括方法符合率、检出限、抗干
扰能力、交叉反应等。
2. 如果检验程序适用样本类型包括血清与血浆，实验室在临床检测时同时使用 血清与血浆，应进行血清与血浆结果一致性的验证。
3. 实验室应根据检测项目的预期用途以及生产制造商声明，选择对检测结果质量有重要影响的参数进行验证。
（二）性能验证方案
1. 方法符合率：通过参比方法比较。
① 样本：
◆ 选取阴性样本至少 5 例、阳性样本（宜包含弱阳性/低扩增的样本）， 一般不少于 10 例样本。
注 1：罕见或少见病种的项目，可酌情减少样本例数。
注 2：若弱阳性/低扩增样本不好获取，可用适当稀释阳性样本获得类似的效果。
② 验证方法：
◆ 按照患者样本检测程序，采用参比方法和候选方法平行检测。
◆ 将所有检测结果按下表汇总填表，计算符合率。
阳性符合率=a/(a+c)×100%
阴性符合率=d/(b+d)×100%
总符合率=(a+d)/( a+b+c+d)×100%
③ 判断标准：
◆ 实验室性能验证结果的判断标准是厂商或研发者在试剂盒或检测系统说明书中声明的性能指标。
2. 检出限：验证厂家试剂使用说明书等有声明检出限。
① 样本：
◆ 定值标准物质（如：国际参考品、国家参考品、厂家参考品）。
◆ 对于报告具体基因型的方法，其选用的标准物质需包括所有的突变类型。
② 验证方法：
◆ 使用定值标准物质的样本梯度稀释至厂家声明的检出限浓度。
◆ 可重复测定 5 次或在不同批内对该浓度样本进行 20 次重复测定（如测定 5 天， 每天测定 4 份样本）。
◆ 稀释液可根据情况选用厂家提供的稀释液或阴性血清，该阴性血清除被验证的目标物必须阴性外，所含干扰物质浓度必须在厂家声明的范围之内。
③ 判断标准：
◆ 如果是 5 次重复检测，必须 100%检出靶核酸；
◆ 如果是 20 次检测，必须检出 至少 18 次靶核酸。
3. 交叉反应：
对于病原体核酸检测来说，主要指与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体核酸，宜在病原体感染的医学决定水平进行验证。
① 验证方法：
◆ 对于病原体核酸检测，取一定浓度与待测核酸可能存在交叉反应的病原体加入样本保存液或经确认为阴性的样本中，与常规样本一样处理，至少重复检测3次；
◆ 对于基因型检测，取一定浓度经其它方法（如测序等）确认为其它基因型的样本，与常规样本一样处理，至少重复检测3次。
② 判断标准：
◆ 结果应为阴性。
4. 抗干扰能力
分子诊断常见的干扰物质主要包括血红蛋白、甘油三酯、胆红素、免疫球蛋白 G、类风湿因子和药物等。实验室可根据临床需求、厂家声明和样本特点（实际可能存在的干扰物质及达到的浓度）选择需要验证的干扰物质及浓度。需要时，也应评估抗凝剂和样本保存液等对结果的影响。
① 验证方法：
实验室可根据实际情况选择验证方案。
◆ 方案 1：实验组为在弱阳性样本中加入干扰物质溶液（对照组加入等量的溶剂），使得干扰物质的终浓度与厂家声明的浓度相同，与常规样本一样处理，至少重复测定 3 次以上。
◆ 方案 2：选取含待验证的高浓度水平干扰物质且经确认不含被测物的临床样本作为实验组，选取含低浓度水平干扰物质且经确认不含被测物的临床样本作为对照组。分别在实验组和对照组中加入弱阳性样本（量小于 10%），与常规样本一样处理，每组至少重复检测 3 次。
② 判断标准：
◆ 方案 1：弱阳性样本检测仍为弱阳性结果，则验证通过。
◆ 方案 2：如果对照组和实验组结果均为弱阳性，说明在验证浓度下，干扰物质对测定无显著影响。如果对照组结果为弱阳性，实验组结果为阴性，说明在验证浓度下，干扰物质对测定有显著影响。
二、PCR定量检测项目
（一）性能验证参数
1. PCR 定量检测选择验证的性能指标宜包括测量正确度、测量精密度（含测量重复性和测量中间精密度）、测量不确定度、分析特异性（含抗干扰能力）、分析灵敏度、检出限和定量限、线性区间（可报告区间）等。
2. 如果检验程序适用样本类型包括血清与血浆，实验室在临床检测时同时使用 血清与血浆，应进行血清与血浆结果一致性的验证。
3. 验室应根据检测项目的预期用途以及生产制造商声明，选择对检测结果质量有重要影响的参数进行验证。
（二）性能验证方案
1. 正确度验证：实验室可采用偏倚评估、回收试验、与参考方法比对等方式进行正确度的验证。
① 偏倚评估：
◆ 样本: 按照如下优先顺序选用具有互换性的标准物质或基质与待测样本相类似的标准物质：
1)有证标准物质（CRM），包括国家标准物质（如 GBW）、国际标准物质（如WHO、IFCC）、CNAS 认可的标准物质生产者（RMP）提供的有证标准物质、与我国签署互认协议的其他国家计量机构提供的有证标准物质（如NIST、JSCC）等；
2)标准物质（RM），如厂商提供的工作标准品；
3)正确度控制品；
4)正确度验证室间质评样本，如 CNAS 认可的 PTP 提供的正确度验证样本。宜根据测量区间选用至少 2 个浓度水平的标准物质样本。
◆验证方法：
每个浓度水平的标准物质样本至少每天重复测定 2 次，连续测定 5 天，记录检测结果，计算全部检测结果的均值，并按公式计算偏倚。
偏倚 = 结果均值 − 参考值
② 与参考方法比对：
◆ 样本：
适宜的临床样本，不少于 8 份，被测物浓度在测量区间内均匀分布，并关注医学决定水平。
◆ 验证方法：
按照患者样本检测程序，采用参比方法和候选方法平行检测。
按照制造商说明书或作业指导书规定的方法对实验方法进行校准/校准验证，宜在相同时段内完成对同一样本的两种方法平行检测，每份样本每个检测方法重复检测 3 次，计算每份样本两种方法检测结果的均值，并按照公式计算偏倚。
偏倚 = 结果均值 − 参考值
2. 精密度验证：精密度验证应包括重复性和中间精密度。
① 样本：
◆ 可采用新鲜或冻存的样本。
◆ 当样本中待测物不稳定或样本不易得到时，也可考虑使用基质与实际待检样本相似的样本，如质控品。
◆ 应至少评估 2 个水平样本的不精密度。当 2 个水平样本的不精密度有显著差异时，建议增加为 3 个水平。
◆ 所选样本的被测物水平应在测量区间内，适宜时，至少有 1 个样本的被测物水平在医学决定水平左右。
注意：
注 1：通常较高值样本的不精密度较小，较低值样本的不精密度偏大。对低值有临床意
义的检测项目，宜评估有判断价值的低水平样本的不精密度。
注 2：如检测结果没有明确的医学决定水平，可在参考区间上限左右选一个浓度，再根
据检验项目的特点在测量区间内选择另一个浓度。
注 3：如与厂商或文献报导的不精密度比较，所选样本水平宜与被比较的样本水平接近。
② 重复性验证：
◆ 验证方法： 对样本进行至少 10 次重复测定，计算均值、SD 和 CV。
◆ 质量控制： 实验过程中应至少检测一个质控品。当质控结果失控时，不论实验结果是否满意都应弃去不用，重新进行试验以取得全部实验数据。
◆ 数据分析：依据实验数据计算均值和标准差。
③ 同时验证重复性和中间精密度：
◆ 验证方法：每天检测 1 个分析批，每批检测 2 个水平的样本，每个样本重复检测 3～5 次，连续检测 5 天。在每一批次测量中，应同时测量质控品。
◆ 数据分析：
3. 可报告范围验证：:定量分析方法的可报告范围是临床实验室发出检验报告的依据之一，可报告范围的验证包括可报告低限（定量下限）与可报告高限（定量上限×样本最大稀释倍数）。
① 样本
◆ 宜选择与待测样本具有相同基质的样本。
② 样本准备
◆ 以血清样本为例。
低值样本准备：将待测样本（含被分析物）用混合人血清（含被分析物浓度水平较低）或 5%牛血清白蛋白生理盐水溶液进行稀释，产生接近于方法测量区间低限（定量下限）浓度水平的样本，通常为 3～5 个浓度水平，浓度间隔应小于测量区间低限的 20%。
高值样本准备：使用混合血清或 5%牛血清白蛋白生理盐水溶液或测定方法要求的稀释液对高值待测样本（必要时可添加被分析物，并计算出理论值）进行稀释，使其接近于线性范围的上 1/3 区域内，并记录稀释倍数。至少选用 3 个高浓度样本，稀释倍数应为方法性能标明的最大稀释倍数并适当增加或减小稀释比例。
③ 验证方法
◆ 在一次运行中将每个低值样本重复测定 5～10 次，每个高值样本重复测定 3次。
④ 数据分析
◆ 分别计算每个低值样本的均值、SD、CV 值。
◆ 对高值样本，计算乘以稀释倍数后的还原浓度和相对偏差。
⑤ 可报告范围的确定
◆ 可报告范围低限（定量下限）
以方法性能标示的总误差或不确定度为可接受界值，从低值样本结果数据中选取总误差或不确定度等于或小于预期值的最低浓度水平作为可报告范围低限。
◆ 可报告范围高限
选取还原浓度与理论浓度的偏差（%）等于或小于方法预期偏倚值时的最大稀释倍数为方法推荐的最大稀释倍数，测量区间的高限与最大稀释倍数的乘积为该方法可报告范围的高限。可报告范围高限的确定应考虑临床需求。
注：超出可报告范围时，实验室检测结果不能满足其预期总误差或不确定度的要求。
4. 分析特异性验证
① 样本
◆ 宜选取被测量水平不同的 2 个样本为基础样本，可参考医学决定水平或参考区间限值。
② 干扰物质选择
◆ 宜根据检测方法的原理和预期用途选择常见的可能产生干扰作用的物质。
③验证方法
◆ 干扰物原液中干扰物的浓度应高于实验浓度 20 倍以上，以减少对基础样本基质的稀释作用。
◆ 重复检测（n≥3)实验样本和对照样本，分别计算 2 组结果均值，和均值间的差值。
④ 判断标准
◆ 满足干扰标准时的最高干扰物浓度，应符合检测方法规定的要求。
5. 分析灵敏度验证
① 样本
◆ 宜选取与待测样本相同基质的样本，浓度或活性已知，且水平处于参考区间上限（或医学决定水平）附近。
② 验证方法
◆ 在检测方法正常运行的条件下重复检测样本 3 次。
③ 判断标准
◆ 实验结果符合检测程序规定的范围，如企业标准。
资料来源：
CNAS-GL039：2019《分子诊断检验程序性能验证指南》
CNAS-GL037：2019《临床化学定量检验程序性能验证指南》
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