流式细胞仪使用——补偿调节及多色流式配色
流式分析时补偿是否调节，补偿调节是否正确直接关系到最后流式分析结果的正确与否，是除了电压调节之外的另一个重要参数。所以，单独拿出来进行介绍。
（一）补偿的调节
1、补偿产生的原因：
流式荧光通道之间需要调节补偿是因为流式荧光素在相应激光激发后发射的荧光波长并不是完全集中于一个很小的范围，一般是在100nm-200nm之间，多个荧光素之间波长存在重叠，因此一种荧光染料往往可以被2个荧光通道检测到。
以下图的PE荧光信号为例，PE通道接收到的荧光信号除了PE外，还有FITC、PE-eFluor610、PE-cy5和PE-cy7，而且无法判断这几种荧光素发射的荧光信号各自的比例。为了让PE通道代表PE荧光素的荧光信号，流式细胞术用补偿调节的方法实现这个目的：排除PE通道中来自于FITC、PE-eFluor610、PE-cy5和PE-cy7的荧光信号，就是分别设置 'PE-FITC'、'PE-PE-eFluor610'、'PE-PE-cy5'、'PE-PE-cy7'的补偿值，使PE通道完全代表PE的荧光信号；
2、如何调整补偿：有以下原则
①多色实验（超过单色）时，所有荧光染料都要做一个单染孔
②先设置电压，再调整补偿，保证读取样本时的电压与调整补偿的电压一致，也就是说补偿调好之后，不要再改变电压。
③有些抗原表达弱，阳性群不明显，例如IFN-γ-PE，我们可以替换为CD3-PE或补偿微球替换。
具体操作方法：假如以调节FITC和PE之间的补偿为例，因为有2种荧光素偶联抗体，故要设置2个单染管，设置方法如下：
| 样品序号 | 标记方法 | 目的 |
| 1 | 空白 | 阴性对照 |
| 2 | 标记FITC-抗CD4抗体 | 调节PE-FITC补偿 |
| 3 | 标记PE-抗CD8抗体 | 调节FITC-PE补偿 |
| 4 | 同时标记FITC-抗CD4抗体和PE-抗CD8抗体 | 观察补偿后的调节效果 |
FITC单染管：未标记PE偶联抗体，但纵坐标PE通道却有FITC的荧光信号（图A），因此需要将PE中接收到的来源于FITC荧光素的信号扣除，就是设置PE-FITC补偿值。 图B所示的是正确调节PE-FITC补偿值后的散点图，此时PE通道基本接收不到来源于FITC荧光素的信号，而且FITC阳性的细胞群和阴性的细胞群处于同一垂直线上（要求就是横平竖直）。 图C所示的是过度调节PE-FITC补偿值的散点图，FITC阳性的细胞群通道信号明显低于阴性的细胞群。
PE单染管：未标记FITC偶联抗体，但横坐标FITC通道却有PE的荧光信号（图D），因此需要将FITC中接收到的来源于PE荧光素的信号扣除，就是设置FITC-PE补偿值。 图E所示的是正确调节FITC-PE补偿值后的散点图，此时FITC通道基本接收不到来源于PE荧光素的信号，而且PE阳性的细胞群和阴性的细胞群处于同一垂直线上（要求就是横平竖直）。 图C所示的是过度调节FITC-PE补偿值的散点图，FITC阳性的细胞群通道信号明显低于阴性的细胞群。
有时双色分析不能满足实验需求，需要进行多色分析，设置方法同双色分析一样，依次调整分析。一般相邻的荧光通道之间需要调节补偿，相隔的荧光通道之间因为各自接收的波长范围相差较大，一般不需要调节补偿，如FITC通道和PE-Cy5通道之间一般不需要调节补偿，因为FITC荧光素发射的荧光波长一般达不到PE-Cy5通道接收的荧光波长的范围；同理， PE-Cy5荧光素发射的荧光一般也不会被FITC通道接收。
3、关于补偿的计算，调节补偿时分析系统自动会得出结果的，公式如下：
4、补偿对结果的影响：不调补偿、补偿不足或补偿过度均会对分析结果产生一定的影响。
5、影响补偿的因素：
（1）电压：电压对补偿的影响不小，电压变补偿变，所以我们前面提到先调节FSC、SSC和荧光通道的电压，电压调好之后再调补偿。
（2）荧光素偶联抗体：目前荧光素种类很多，大致可以分为有机小分子染料、荧光蛋白、复合染料、大分子染料、量子点，优缺点见下图：
尽管荧光素种类多，但由于有些荧光素发射的荧光波长不是绝对的集中，会溢漏到其他通道，需要调节补偿，所以选择时需了解清楚常见的荧光溢漏：
405nm激光激发的染料：
488nm激光激发的染料：
637nm激光激发的染料：
（3）细胞：也是影响补偿大小的一个因素，尤其是当细胞的理化性质相差较大时，如淋巴细胞和肿瘤细胞之间、活细胞与固定后细胞之间，标记相同的荧光素偶联抗体，使用相同的通道时，各通道之间的补偿可能不同，所以当细胞理化性质差异较大时，最好重新调节新的样品细胞的补偿，确保获得准确的流式结果。
（二）多色流式如何配色
原则1：查看所用流式细胞仪的配制，包括激光器、光路设计以及滤光片等，确定有哪些染料可用。
原则2：抗原的表达与荧光遵循强弱搭配，即高表达的抗原选用弱荧光、低表达的抗原选用亮荧光。关于某种抗原的表达强弱可以从文献上进行查找，下表列举了一些抗原的表达情况及荧光染料的相对亮度：
原则3：荧光染料重叠最小化
（1）如果仪器条件允许，尽量采用多激光激发减少重叠
（2）同一细胞上的抗原尽量减小光谱重叠
原则4：尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本，因为自发荧光强度在波长较长时迅速降低，例如APC荧光素
常见染料搭配，仅供参考：
（三）流式分析中的死细胞问题
样品细胞中一般都含有一定量的死细胞，死细胞也可以产生非特异性荧光，而且死细胞产生的非特异性荧光要明显强于活细胞，有的甚至强于荧光素产生的荧光信号。流式分析的目标是活细胞，如果在流式分析时将死细胞当作活细胞来分析，也会严重影响流式分析结果，例如下图：
常见的区分细胞死活染料有:
（1）细胞膜非同透性细胞染料，通过受损的细胞膜，标记死细胞核酸，不能透过活细胞细胞膜，常见的有PI、7-AAD;
（2）可固定的死细胞染料，适用于胞内免疫分析标记，种类很多。
从以下20个热点入手，每天给大家分享干货：
| 1 | miRNA非经典机制 | 11 | 肠道菌群 |
| 2 | lncRNA的10种机制 | 12 | 细胞自噬 |
| 3 | circRNA | 13 | 细胞焦亡、铁死亡 |
| 4 | 单细胞测序 | 14 | 间充质干细胞 |
| 5 | 转录因子 | 15 | 肿瘤干细胞 |
| 6 | 可变剪接 | 16 | 外泌体 |
| 7 | SNP | 17 | 氧化应激 |
| 8 | 泛素化修饰 | 18 | 调节性T细胞 |
| 9 | 组蛋白修饰 | 19 | RNA甲基化修饰 |
| 10 | 蛋白激酶和磷酸酶 | 20 | 肿瘤微环境 |
而这些研究方向参与疾病发生发展过程的分子机制，可以归纳总结为一下几类研究：
①分子（DNA、RNA、蛋白质、小分子）的表观遗传修饰；
②分子拷贝数的表达变化差异；
③RNA分子的剪接加工、出核、细胞组织水平的时空变化研究；
④特殊的一群细胞类型研究、细胞通讯微环境研究；
⑤具有临床应用潜力的新技术（CRIPSR）或者载体（膜结构、细胞等）；
⑥关注细胞生理学现象：自噬、凋亡、线粒体失功等；