KI细胞系构建注意事项

KI细胞系的构建流程是先设计sgRNA及Donor模版，然后通过核糖核蛋白法（Ribonucleoprotein, RNP）或质粒法等方法将sgRNA、Cas9蛋白和Donor模板转进细胞中。以RNP法为例，将合成的sgRNA、纯化后的Cas9蛋白和Donor模板电转进目标细胞中，通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过程中，sgRNA的设计、Donor模板的设计等均会影响最终的编辑结果，下面我们总结了会影响基因编辑效率的部分原因：

1. sgRNA的设计

sgRNA-Cas9在KI基因编辑系统中如“剪刀”一般精准切开双链DNA，这把“剪刀”锋利与否和精确度能直接影响KI基因编辑系统的编辑效率。而sgRNA的设计就是重要的一步，它能影响目的片段能否精准插入和切割效率。因此需要综合多方面因素来科学设计sgRNA。在设计时要综合考虑候选编辑位点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点等信息。可以参照以下原则设计sgRNA：

（1） 候选编辑位点的正链靶点和负链靶点的切割效率相同，都可以设计靶点；

（2） 靶点的GC含量尽量不要低于40%，靶点序列GC含量偏高（50-70%）有较高的打靶效率；

（3） 靶点内不要有连续4个以上的T碱基，以防成为RNA Pol III的转录终止信号；

（4） 为了避免或减少非特异脱靶突变，应进行靶点特异性分析。推荐使用CCTop（https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/）在线网页进行预测。最后挑选切割效率高、特异性好的一条或多条sgRNA开展实验。

2. RNP法和质粒法的选择

细胞内存在Cas9蛋白和sgRNA是实现基因敲入的重要一步。表达Cas9蛋白和sgRNA的常用方法有核糖核蛋白法（ ribonucleoprotein, RNP ）和质粒法等。

3. Donor模板的设计

Donor模板对同源重组的效率具有重要的影响。在实验过程中需要考虑以下因素：

（1）插入位点与双链DNA缺口（Double Strand Breaks，DSB）的距离。距离不应该超过100 bp，而最理想的距离是在10 bp以内。如果超过这个距离，重组效率会大大降低。

（2）敲入片段的长度。短片段的敲入（如Tag标签等）可以使用ssODN。长片段的敲入则需要dsDNA质粒作为修复模板，需要注意的是敲入的片段不能过长，一般不超过5 kb（包含抗性和荧光筛选），过长会降低重组效率。

（3）同源臂的长度。一般而言，加长同源臂能一定程度上提高重组效率。并且插入的片段越大，所需要的同源臂长度越长，而同源臂一般选取约1500 bp较为合适。

（4）同源臂模板的选择。同源臂建议以待突变的目的细胞基因组为模板扩增，避免不同细胞基因组差异导致同源臂不同源，降低重组效率。

4. 细胞类型与生长状态

在瞬转之前应注意细胞类型是否合适，如关注细胞的增殖速度，增殖太慢的细胞发生重组效率也低下。还要保证细胞处于良好的生长状态、处于对数生长期、合适的生长密度、无支原体污染等。

5. 瞬转电压

合适的瞬转电压能影响编辑效率和细胞的存活，电压过低会影响编辑效率，电压过高会使细胞死亡。因而需要摸索不同细胞类型的合适瞬转电压。一般而言，转瞬电压和细胞的直径有关系，直径越大电压越低。建议结合预实验，选择最佳的瞬转电压。