单细胞多组学揭示PD-L1免疫治疗联合紫杉醇化疗在三阴性乳腺癌中的作用机制
今天小编给大家分享一篇近期发表在《Cancer Cell》杂志上题为“Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated withresponse to PD-L1 blockade in triple-negative breast cancerr”的文章：
在这篇文章中，研究者利用scRNA-seq , scTCR-seq和scATAC-seq来检查 22 名接受紫杉醇或其与抗 PD-L1的 atezolizumab 联合治疗的晚期 TNBC 患者的免疫细胞动力学。研究者证明高水平的基线 CXCL13 T 细胞与巨噬细胞的促炎特征有关，并且可以预测对联合治疗的有效反应。在反应性患者中，淋巴组织诱导物 (LTi) 细胞、滤泡 B (Bfoc) 细胞、CXCL13 T 细胞和常规 1 型树突细胞 (cDC1) 在联合治疗后一致增加，但在紫杉醇单药治疗后减少。研究者的数据强调了 CXCL13 T 细胞在对抗 PD-L1 疗法的有效反应中的重要性，并表明通过紫杉醇方案减少它们可能会损害伴随 atezolizumab 治疗 TNBC 的临床结果。
研究设计
样本：22例TNBC患者（11例接受阿替利珠单抗联合紫杉醇化疗，11例接受紫杉醇单药化疗）治疗前后的78例配对样本。
测序：单细胞转录组测序（scRNA-seq）、T细胞受体序列测序（scTCR-seq）和染色质可及性测序（scATAC-seq）
结果
晚期TNBC患者的免疫细胞动力学
经过质量过滤，获得了489490个高质量免疫细胞的单细胞转录组数据，其中包括骨髓细胞、先天淋巴细胞（ILCs）、T细胞和B细胞（图1B）。发现在联合治疗组中，B细胞在应答性肿瘤中主要富集，而髓细胞在非应答性肿瘤中富集。两组有效治疗后B细胞减少，T细胞增加。之后根据预测指数(Pi)和治疗指数(Ti)系统地研究不同的免疫细胞类型与临床反应的关系。发现B细胞是最突出的免疫细胞类型，可以预测对两种治疗方案的有利反应（图1C）。与化疗相比，T细胞在联合治疗中明显表现出Ti阳性(图1C)，这表明阿特珠单抗可能通过提高T细胞水平来促进有效反应。为了在人类TNBC中生成一个全面的免疫细胞图集，进一步将来自血液或肿瘤的每一个主要免疫室单独隔离（STAR方法）。揭示了具有不同分子特征的异质免疫细胞亚型，表明它们具有独特的细胞特征（图1B、1D）。
CD8-CXCL13和CD4-CXCL13在联合治疗的TNBC肿瘤中扩增
由于T细胞在PD-L1阻断治疗中发挥核心作用，因此研究者分析了治疗中各个T细胞亚型的特征，发现CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 在 TNBC 肿瘤中扩展。CD8-CXCL13表达TIGIT、CTLA4和LAG3的T细胞耗竭相关基因，CD4-CXCL13表达BHLHE40、TOX2和CXCR5，但也表达了耗尽标志物(图2A)，CD8-CXCL13和CD4-CXCL13的耗竭特征暗示了它们的肿瘤反应性。在紫杉醇化疗组中，与非响应者相比，响应者显示CD8-CXCL13、CD4-CXCL13和Tregs水平下降，同时在紫杉醇治疗后CD8 Tem、Teff和CD4细胞水平升高（图2B、2C）。而CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 在紫杉醇加阿特珠单抗治疗后，在反应灵敏的患者中都有所扩大，导致他们在联合治疗组中所占的分数高于单独的紫杉醇治疗（图 2B、2C ）。Ti分析也显示，CD8-CXCL13和CD4CXCL13在联合治疗后扩增，而在应答患者中紫杉醇治疗后减少(图2D)。提示CXCL13 T细胞与PD-L1封锁的相关性。
利用TCR序列来追踪对联合治疗反应的肿瘤中CXCL13 T细胞的谱系起源，发现它们的扩增既包含已存在的克隆，也包含新浸润的克隆(图2E和2F)。
与联合治疗的耐药患者相比，应答患者表现出更高的CD8-CXCL13和CD4-CXCL13水平(图2B和2C)，这表明CXCL13 T细胞在形成抗PD - L1治疗的临床结果中具有重要意义。Pi分析也表明，较高水平的CXCL13 T细胞可以预测对联合治疗更好的反应(图2D)。
CXCL13 T细胞和相关B细胞预测抗PD - L1免疫治疗的良好反应
由于在联合治疗组中，B细胞在应答性肿瘤中主要富集，因此研究者研究了CD19 B细胞与CD8-CXCL13和CD4-CXCL13 T细胞的关系，发现在TNBC肿瘤中与紫杉醇加阿特朱单抗（图3A）的共定位。
通过比较反应性肿瘤和非反应性肿瘤之间B细胞的转录差异，发现在反应性肿瘤中富含的B细胞，在抗原处理和表达途径、干扰素（IFN）-γ反应和T细胞活化等途径中具有高度表达的基因。相比之下，富含非反应性肿瘤的B细胞在B细胞活化、免疫球蛋白生成和幽默免疫反应的通路中表现出高度表达的基因（图3B）。
对B细胞亚型（naive B (Bn)、memory B (Bmem)、Bfoc、增殖Bmem和增殖Bfoc亚群组成）分析发现Bfoc 和 Lti 细胞在 TNBC 肿瘤中协同扩张，对组合疗法有反应。值得注意的是，Bn、Bmem 和 Bfoc 细胞主要富集于对紫杉醇和阿特朱单抗有反应的肿瘤，而不是对紫杉醇有反应的肿瘤（图 3C ）。反应者比两个治疗组的非反应者的基线Bfoc水平要高得多，Pi分析也显示了Bfoc与有利的临床反应的关联性（图3D）。因此，Bfoc似乎是患者生存和ICB免疫治疗中最重要的B细胞子集。研究Bfoc与其他免疫细胞关系发现CD4-CXCL13和CD8-CXCL13在细胞比例上与Bfoc呈高相关性，特别是在治疗后组（图3F）。此外，ILC3-IL7R可以预测对这两种治疗方案的有利反应（图3J），表明其在有效抗肿瘤免疫方面的潜在作用。
cDC1在 TNBC 肿瘤中扩展，对组合疗法有反应
mDC与TNBC肿瘤中的cDC1紧密相连，由于其转录相似性和细胞比例的相关动态变化（图4C，4D）。对于使用紫杉醇加阿特珠单抗治疗的患者，发现与 cDC1 和 pDC 的增加相比，治疗后响应者中的 mDC 减少，这可能是由于紫杉醇方案选择性地减少了 mDC（图 4B）。值得注意的是，mDC 和 cDC1 都展示了与 CD4-CXCL13协调的时间动力学（图 4D ），我们通过 TCGA BRCA 的批量 RNA-seq 数据（图 4F）证实了它们的相关性。此外，我们还发现了多个配体受体对，包括 CD40LG-CD40，这些配体受体对可能会在 mDC、cDC1 和 CD4-CXCL13（图 4G）之间进行调停。此外，CD8-CXCL13还表现出与mDC、cDC1和CD4-CXCL13的高度相关性，基于它们在细胞比例上的时间动态（图4D和S4H）。这些观察暗示CD4-CXCL13和CD8-CXCL13可能都由cDC1或mDC激活。
巨噬细胞表型与TNBC肿瘤中CXCL13 T细胞相关
组合治疗组的响应者相比，无相应者中表现出较高的巨噬细胞基线水平，无相应者中富含的巨噬细胞高度表达SPP1、TREM2、FN1和C3，而在响应者中富含的巨噬细胞则高度表达CXCL9、MMP9和PLA2G2D （5A）。并且，MΦ-CCL2和MΦ-MMP9，以及mDC和其他DC亚型，都是排名最高的免疫亚型(图5C)。
两个巨噬细胞亚群，MΦ-CCL2和MΦ-MMP9与CXCL13 T细胞（图5E）高度相关。这两种巨噬细胞亚群的高基线水平表明联合治疗的良好反应(图5F)。NicheNet分析显示，MΦ-CCL2和MΦ-MMP9的关键特征基因，包括CXCL9和CXCL10，与IFNG和TNF相关(图5)，表明TME中积极的抗肿瘤免疫反应可能塑造了巨噬细胞的促炎表型。与无应答者相比，我们一致观察到在紫杉醇加阿特珠单抗应答的肿瘤中MΦ-MMP9和CD8-CXCL13同时富集(图5G)。
CD8-CXCL13在抗 PD-L1 治疗后表现出增强的细胞毒性
对抗 PD-L1 治疗后CD8-CXCL13 分析发现，IFNG、GZMK、GZMA和CD44的效应基因和记忆相关基因以及TBX21、BHLHE40和 BCL6 的转录因子（TFs）、CD28和ICAS的共刺激分子、HLA基因在抗 PD-L1 治疗后CD8-CXCL13 中升高，而耗竭相关的基因，包括HAVCR2，LAYN，TIGIT和LAG3，在治疗后在CD8-CXCL13中被降低（图6A).CD8-CXCL13的表型变化也反映在其耗竭分数的减少和效应者记忆分数的增加（图6B）。CD8-CXCL13 和 CD8 Tem 在 IFNG，GZMK,和 PDCD1 中都含有开放染色质区（OCRs ）位点。然而， CD8 - CXCL13 表现出不同于 CD8 Tem 的细胞状态，这是由于它们在 CXCL13 、 CTLA4 和 LAYN 中富集了 OCR （图6C）。比较组合治疗前后的配对 scATAC-seq 数据，检查了 CD8 Tem、CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 的色度素可及性的全局动态。发现CD8-CXCL13细胞CD44、CXCR4、KLRG1、XCL2、CST7、ICOS和CD28的可及性增强，而治疗后与衰竭相关的基因（如CREM和 MYO7A）的可及性降低（图6D）。
即，在TNBC肿瘤中，紫杉醇方案可以选择性地减少关键的抗肿瘤免疫细胞，但提高免疫抑制巨噬细胞，因此可能不利于联合atezolizumab 。尽管在治疗过程中，免疫细胞动力学也可能受到疾病进展的影响，但对比应答者和应答者的一致模式表明它们与紫杉醇方案有关。关键抗肿瘤免疫细胞的减少可能是由紫杉醇的直接和选择性损伤引起的，可能是由于潜在的肿瘤反应性T细胞的增殖状态。
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