【衡道】三种细胞蜡块制作方法的对比分析

前一阵我们编译了《常规细胞块失效的替代办法探讨》一文，探讨了当常规细胞块缺乏足够的细胞量时，使用细胞转移技术（CTT）将多种免疫染色应用于单次直接涂片的做法。此文则介绍了目前国内医院病理科所采用的一种现实解决方案，供大家讨论商榷。

广东省佛山市

第一人民医院病理科

许欣 副主任技师

许欣  刘芳  张鑫  刘情  邓远斐  张淦梅

广东省佛山市第一人民医院病理科

在脱落细胞常规涂片检查中，对细胞量较少，散在分布的标本，结构不清时，诊断尤为困难，针对这一问题，我们特别对细胞量少的胸腹水，尿液，穿刺细胞标本，进行三种不同的细胞蜡块（Cell Block ,CB）制作，有效充分地收集量少的标本，提高了细胞病理学诊断的符合率^[1、2]。本文用三种不同细胞蜡块制作方法，从制作流程、操作时间及细胞量收集进行对比分析。结果：采用第二代新的细胞蜡块试剂盒制作方法，制作耗时短、简便、快捷，能够增加细胞量收集，提高细胞学检查的诊断符合率，在免疫细胞组化及分子检测中也得到较好的效果。

1. 材料与方法

1.1 材料： 

1.1.1 收集本院2017.6-2017.8细胞量少的标本共30例，其中胸腹水脱落细胞标本、尿液脱落细胞液基标本、穿刺细胞液基标本各10例。

1.1.2 液基细胞保存液、两代细胞蜡块试剂盒、免疫组化单克隆抗体ER 、PR、ki67、GATA3及HER-2/neu/TOP2A/CSP17多色FISH检测试剂盒

1.2 方法： 

1.2.1 常规涂片：三组每例均做一张常规涂片，95%酒精固定，常规HE制片。

1.2.2 细胞蜡块制备：分三组。第Ⅰ组穿刺细胞标本注入95%酒精：10%中性缓冲福尔马林1:1固定液5ml，混匀后离心沉淀3min(2500 r/ min)；胸腹水及尿液脱落细胞自然沉淀1-2h后，离心沉淀3min(2500 r/ min)，弃掉上清液，注入95%酒精：10%中性缓冲福尔马林1:1固定液5ml混匀再离心沉淀。两种标本沉淀物均用细胞蜡块试剂盒（第一代）中试剂A、B进行处理，专用纸包裹细胞标本。第Ⅱ组穿刺细胞标本注入细胞保存液5ml混匀（或静止15min）离心沉淀3min(2500 r/ min)；胸腹水及尿液脱落细胞自然沉淀1-2h后离心沉淀3min(2500 r/ min)，弃掉上清液，两种标本沉淀物均用细胞蜡块试剂盒（第二代）试剂A、B进行处理（试剂B成分与第一代不同）。第Ⅲ组胸腹水及尿液标本先放置4°C冰箱过夜沉淀后，用95%酒精:10%福尔马林1:1固定液5ml离心沉淀10min(3000 r/ min)，烟纸包裹（常规包埋）细胞标本。最后三组包裹好的细胞沉淀物均放入脱水机中进行快速脱水、透明、浸蜡、包埋，一次性连续切片5 - 10张，厚度4μm，1 - 2张HE染色，余送免疫组化及分子室备用。两代试剂A离心时间10min(800 r/ min)，第二代试剂B离心时间2min(800 r/ min)，第一代试剂B震荡10S。

1.2.3 免疫细胞化学：试剂选用单克隆抗体ER、PR、ki67、GATA3。Envision 二步法对细胞蜡块常规切片进行免疫细胞化学染色，均有组织芯片作阳性、阴性对照。

1.2.4 FISH检测：选用乳腺癌HER-2/neu/ CSP17(CEP17)多色检测试剂盒，按FISH检测程序染色。

2.结果

常规涂片HE染色细胞稀少，分散（见图1）；三组细胞蜡块对比，第Ⅱ组方法程序最简单，耗时最短（注：细胞蜡块采用的是快速脱水法脱水）简便、快捷，细胞数量多， 细胞蜡块切片HE染色（见图2）。细胞蜡块切片免疫细胞化学染色，细胞数量多，阳性部位定位准确，背景干净（见图3）；细胞蜡块切片FISH检测染色，细胞数量多，粘附性好，荧光阳性信号强，红蓝信号清楚（见图4）。

图1  细胞量稀少

图2 细胞量较多

图3  免疫组化检测

图4  FISH检测

表：三组不同细胞蜡块制作法的对比观察表

3. 讨论

细胞学检查的方法有离心沉渣涂片HE制片法和液基制片法等。固定液品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。

细胞涂片常用的固定液是95%乙醇，其固定作用是使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。优点：穿透性强、抗原性保存好。缺点：脱水性强，易引起细胞收缩。

10%中性缓冲甲醛固定液可形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色。

细胞涂片一般不单纯使用甲醛固定液，本实验中也发现，用甲醛固定过夜的涂片，固定时间越长HE染色效果越差，核染色灰蒙、伊红不易上色甚至拒染。此原因也许是细胞通透性好，固定时间长，产生甲酸有关。细胞目前液基细胞制片法用细胞保存液，它不光有固定细胞的作用，经多次冲洗离心、保存液还能够去除部分红细胞的作用。

不论常规涂片或液基制片，对细胞量较少的标本其制作的涂片往往附着的肿瘤细胞少，有时出现细胞成团、重叠、挤压等现象，影响病理诊断，同时也不能进行后续的免疫组化及FISH检测。这种方法虽然简单快捷，但比起细胞蜡块来说阳性检出率较低，漏诊率较高。针对这些问题本文采用直接离心固定，细胞蜡块制作法及两种不同细胞蜡块试剂盒制作法的对比观察，应用细胞蜡块试剂盒能够更充分、更有效地收集细胞数量。

两代细胞蜡块试剂盒中试剂A均有固定作用，为中性缓冲福尔马林和伊红混合液等；试剂B第一代为粉状，第二代为液状，试剂B均为支持物，对支持物（基质成分）的要求：

（1）能够将细胞凝结成半固态形状的生物材料，形成细胞支架，将细胞单个网在其中；

（2）液态＜—＞半固态；

（3）不影响DNA（RNA）、蛋白质的性质，通过实验已证实可做免疫细胞化学和分子病理检测。相对于组织活检常规石蜡切片，细胞蜡块（CB）更具有细胞新鲜、抗原保留完整的明显优点。

结果表明第Ⅱ组细胞蜡块试剂盒效果最佳。收集的细胞集中，背景清晰，清除了部分血细胞、炎症细胞及粘液，不会出现细胞重叠拥挤、厚薄不一的现象，并可长期保留标本。可连续切片，用于后续的免疫细胞化学及分子检测，定位准确可靠、背景清、可重复性高，提高了细胞病理学诊断的准确率[3、4]及方便质控管理，从而帮助临床手术分析，指导临床个体化、精准化治疗等。

参考文献：

[1] 张穗，杨广英，孙莉，等. 细针穿刺微小组织沉淀蜡包埋技术[J]. 临床与实验病理学杂志，2002，18 (3) :282

[2] 郭智俊，彭桂香，潘乃梁. 胸腹水沉淀物琼脂石蜡双包埋切片法与常规涂片法的对比[J]. 临床与实验病理学杂志，2002 , 18(4) : 437.

[3] 丁华新，何向蕾，陈培辉. 免疫细胞化学在胸腹水细胞学鉴别诊断中的应用[J]. 诊断病理学杂志，2002 , (4) : 220 - 221.

[4] 杨文君，任晓冰，沈宝珠，等. 免疫组织化学方法在良恶性胸腹水鉴别诊断中的意义[J]. 实用医学杂志，2004 , 20(4) : 374 - 375.

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