超离纯血清用于制备无外泌体血清的可行性及外泌体去除效率问题

外泌体最早于1981年被鉴定为具有多种核苷酸酶活性的细胞外囊泡囊泡，他们源于各种正常和肿瘤细胞，并在生理和病理状态下发挥着重要功能。细胞外囊泡（EV）还包括微囊泡（MV）、凋亡小体等亚群。外泌体（直径30–150 nm）主要通过胞内体和多泡小体途径进行释放，而微囊泡（直径100–1000 nm）则主要通过从质膜脱落或出芽而从细胞上释放出来。凋亡小体则主要源于凋亡细胞后期的崩解，形成直径为50-5000 nm的细胞囊泡样碎片。

以外泌体为代表的细胞外囊泡是近些年研究的热点，目前的外泌体研究主要通过研究体外培养细胞来源的外泌体，分析其在体内外的功能作用。但是外泌体等细胞外囊泡几乎存在于动物的所有体液之中，在血清中同样有细胞外囊泡的存在。先前的研究表明，培养细胞使用的胎牛血清中也存在大量的细胞外囊泡，直接使用常规的血清培养细胞会对外泌体等细胞外囊泡研究产生可以预见的影响。

目前市面上存在着商业化的无外泌体血清，同时也有不同的策略制备无外泌体血清。我们常见的主要是基于超速离心的无外泌体血清分离方法，之前hzangs曾经撰写过相关的protocol，感兴趣的朋友可以关注往期推文：exosome-free FBS的制备策略及使用技巧。但是随着研究的逐渐深入，针对基于无外泌体血清的超离制备方式存在一定的争议。目前主要有三种策略：1、现将血清与培液按照1:4的比例稀释，然后超速离心10万g持续18小时；2、直接将纯血清超速离心10万g 持续18小时；3、极高离心力下（18万g）持续3~6小时。目前在文章中最常见的是前两种方法。

至于我们如何选择，这就是仁者见仁智者见智的事情了。相信很多朋友比较喜欢超离纯血清 10万g持续18小时，先稀释再超离，确实费时费力！但是，超离纯血清，有些朋友可能会怕被审稿人质疑，怀疑纯血清超离10万g持续18小时的外泌体去除效率。针对这一点，厦门大学颜晓梅教授研究组在其发表在JEV上的研究中对纯血清超离10万g持续18小时的外泌体去除效率进行过简单的评估。

今天将这一结果介绍给大家。该分析策略是这样的，首先对未稀释的血清在4℃进行10万g持续18小时超速离心，取上清作为无外泌体血清。之后将该无外泌体血清稀释数倍，利用超速离心再次分离其中的微粒（包括外泌体等）。最后使用流式细胞仪分析外泌体等颗粒的残留情况。分析结果显示，纯血清超速离心10万g持续18小时可以去除约98%的外泌体等细胞外囊泡。由此可见，纯血清超离去除外泌体等细胞外囊泡是可行的。对于超速离心机使用紧张的研究机构，纯血清超离制备无外泌体血清也是一种可以接受的方法。

参考文献：Ye Tian, et. al. Journal of extracellular vesicels. 2019  PMID:31839906

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