HPLC色谱柱常见故障排除（附多图详细讲解）！
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本文主要从以下四个方面，1. 色谱柱柱压 ；2. 色谱峰峰形 ；3 . 色谱峰保留值； 4 . 色谱柱柱寿命概述如何排除故障。
一、色谱柱柱压
1、柱压高多少正常？
同一条件：新色谱柱，C18，5µm，球形，4.6×250mm，100%甲醇，1mL/min，25℃，管路内径0.3mm（0.010″），通常:＜7MPa。
如果柱压高了，先确认出压力升高的组件，有可能是色谱柱也可能是其他组件的原因。色谱柱污染、填料堵塞、筛板堵塞都会造成压力升高。
2、确定压力升高来源？
保护柱-卸下保护柱，仪器堵塞-卸下色谱柱，色谱柱进口端堵塞-反方向测试（不是反冲！！）如果是色谱柱引起的柱压升高，问题是……
3、冲洗色谱柱
反相色谱柱（C18,C8）
按照以下方式冲洗：
a、 水/乙腈95/5→0/100
b、
如果不行，可在异丙醇里加1%TFA.
使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱，在重新使用反相流动相以前，必须用异丙醇过渡！正相色谱柱（SiO2.Diol），以下溶剂至少各50ml冲洗色谱柱:
原则：使用比MP更强的溶剂冲洗二氯甲烷>丙醇>四氢呋喃>乙醇>乙腈>甲醇>水。那么冲洗色谱柱 一定正确吗？
C18柱上蛋白的冲洗： 是DMSO而不是THF！！
C18柱上淀粉的冲洗： 是水而不是甲醇！！
根据强保留污染物性质，选择合适的冲洗溶剂和程序！！
4、冲洗筛板
强溶剂、反方向、低流速。
反相色谱柱：水/乙腈95/5→0/100
正相色谱柱：
50%甲醇＋50%三氯甲烷→ 100%乙酸乙酯
－冲洗筛板不要连接检测器
－不建议用户自行更换筛板
5、预防柱压过高
a、使用保护柱
b、样品前处理（重点讨论样品类型）
c、经常冲洗色谱柱
d、过滤流动相
e、缓冲液或水不要保存过长时间
6、样品基质如何去除 ？
制剂：淀粉、硅胶、其他添加剂
中药：强疏水性成分
二、色谱峰峰形
常见以下几种情况：色谱峰拖尾、色谱峰分裂、色谱峰扩展，许多色谱峰峰形问题都是复合型问题， 造成色谱峰扩展和柱效降低；色谱峰扩展和拖尾或拖尾随保留加剧。从以下几个方面色谱柱问题、溶剂效应、进样量（过载）、样品的特性、柱外效应来分析。
1、色谱柱问题
污物在柱进口处积聚－强溶剂冲洗柱子
二次保留效应－加入扫尾剂,10mM的TEA
重金属污染－使用高纯硅胶基质色谱柱
对于难溶解的物质：小体积强溶剂溶解以后用MP稀释，扫尾剂：30mM的TEA（B性化合物），醋酸胺（A性化合物）
二次效应
不加TEA 10mM的TEA
ASB C18,4.6×150mm，5µm，85% 25mM NaH2Na，15%ACN 1mL/min, 35℃
硅胶纯度
初始的硅胶基质，酸洗后的硅胶基质，流动相：20mM三甲胺
金属污染C18硅胶造成的碱性药物的拖尾
2、柱外效应
色谱柱：150×0.45mm, 硅胶柱
流动相：Hexane-CAN(99:1,V/V)
流 速：2.0mL/min
(a) 10µL进样阀与8µL检测器流，通池的商品色谱仪
(b) 0.5µL进样阀与1µL检测器流通池的商品色谱仪
柱外效应造成的色谱峰拖尾
3、溶剂效应
样品体积：30µL
流 动 相：18% 乙腈-H2O
分别以纯乙腈和流动相为溶剂注 入咖啡因（A峰）与水扬酸胺（B峰）样品
解决方法：
1、使用流动相溶解样品
2、加大浓度，降低进样量
样品溶剂进样的影响
4、样品特性
葡萄糖端基异构体的转化— 两个峰
提高温度，或提高pH值，转化加快 一个峰
色谱柱：Venusil HILIC 5µm 4.6×250mm；流动相：乙腈－水 (80: 20)；柱温：30℃ ；检测器：蒸发光散射检测器；样品：葡萄糖对照品水溶液，流速：1mL/min
5、柱外效应对峰形/分离度的影响
死体积是指从进样器到检测器的体积，这一段没有被色谱填料所填充的部分，死体积大，会导致峰展宽，峰形变差等等。
6、柱外效应对峰形/分离度的影响
尽量减小连接管路体积。尤其使用窄径柱时！
柱后和检测器之间标配一个两道，去掉后测试明显改善
7、柱外效应主要影响N值
进样量大主要引起柱子超载，保留时间和N值下降，一般凭经验找到是保留时间和N最大的进样量。一般：0.46mm的色谱柱最大进样量为10-50ug。一般开始时大样品量进样（10-50ug），然后逐渐降低进样量直至保留时间稳定。
8、色谱峰拖尾/扩展/分裂
色谱柱污染：复杂样品基体或待测样品量大
颗粒物堵塞筛板：复杂样品基体或待测样品量大
色谱柱死体积：流动相pH>7时，硅胶溶解(除非使用特殊色谱柱)，死体积增加。
样品溶剂效应： 样品溶剂强于流动相-裂分峰和扩展峰取决于样品量
三 . 色谱峰保留值
1、保留时间变化
漂移（单方向增加或减小 ）波动（无规律的变化）
2、保留时间变化原因
色谱柱平衡、固定相变化、色谱柱污染、流动相组成发生变化、疏水坍塌
3、色谱柱平衡
流动相变化（梯度洗脱的平衡）、温度变化、流速变化、更换色谱柱
至少使用10-20倍柱体积流动相平衡色谱柱
4、固定相变化
键合相流失：通常保留时间变短，使用耐酸色谱柱：venusil ASB C18和C8系列
硅胶溶解：裂峰，使用耐碱的色谱柱：Durashell C18 ，RP
5、色谱柱污染
清洗：合适的清洗方式
使用保护柱：请特别注意何时更换保护柱、压力、分离效果、时间、进样次数几个方面。
6、流动相组成发生变化
易挥发性组分挥发：夏天，注意密闭容器，不建议循环使用流动相一相小于10%的在线混合正确配置流动相（V:V）
7、疏水坍塌
C18色谱柱，若没有指明，不得使用100%水作为流动相 （至少含有5%的有机相）使用亲水色谱柱（若水相必须大于95%）：Venusil MP C18、Venusil HLP、Venusil ASB C18，C8
8、建立良好重现性方法
选用质量好的色谱柱、 选用良好的流动相体系、用流动相充分平衡柱子（如MP中含THF，三乙基胺或四丁基铵等胺类调节剂或离子对试剂，特别是烷基上有十个以上的碳原子的情况！）、 采用合适的试验技术，确保日间稳定、 预存色谱柱
四. 色谱柱柱寿命
1、色谱柱的寿命应有多长
a、操作者对色谱柱的使用和处理
b、注入样品的类型
c、干净样品：进样至少2000次。
保证良好柱寿命与性能的方法
总体来说色谱柱常见问题症状是柱压过高、峰形不好、保留时间不稳。一般来说色谱柱常见问题原因如下：
色谱柱筛板问题－筛板或柱床部分堵塞；
强保留的样品组分－吸附样品杂质（污物）；
色谱柱填充不好；
柱压问题－机械或热冲击造成空洞
化学影响－基质或键合相被化学侵蚀
有时此类问题并非由色谱柱引起，而是仪器和实验条件！
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