文献详解|不花大价钱也能轻松发单细胞高分文章！
提到单细胞测序，如果你还是只想到了“太贵”而打算放弃这个科研热点的话，那小编再次提醒你，不要忘了<公共数据库>这一科研利器！用别人的数据，发自己的文章，下面小编就给大家分享一篇单细胞测序纯生信分析的文章，看完之后你肯定会醍醐灌顶，文思泉涌呢！
01
研究背景
三阴乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性乳腺癌亚型，具有广泛的肿瘤间和瘤内异质性，表现出更多的血管生成和上皮-间充质转化(EMT)等临床特征。对肿瘤和肿瘤浸润的免疫细胞进行单细胞水平的分析，有利于揭示TNBC中肿瘤细胞多样性的确切性质，以及肿瘤间和肿瘤内的异质免疫细胞群体。
作者利用GEO及TCGA数据库中的单细胞RNA-seq数据、bulk RNA-seq数据和临床数据，通过生物信息学分析方法，揭示了TNBC中肿瘤的异质性以及M2型肿瘤相关巨噬细胞(M2 TAMs)与临床结果的关系。
02
数据与方法
（1）scRNA-seq数据：单细胞转录组数据(GSE118389和GSE75688)从GEO数据库下载；
（2）Bulk RNA-seq及临床数据:TCGA数据库中的TNBC数据，通过UCSC Xena浏览器下载。
作者通过单细胞RNA-seq鉴定免疫细胞群体，分析肿瘤间和肿瘤内异质性，揭示了肿瘤异质性以肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞为特征，在肿瘤浸润性巨噬细胞中发现高比例的TAMs。之后，作者进行了bulk RNA-seq分析，找出TAMs和生存之间的联系，应用多种生物信息学方法对TNBC中TAMs的生物学特性进行分析，建立了与TAM相关的基因特征，以预测生存和免疫治疗反应。
03
研究思路
04
结果展示
（1）TNBC细胞中肿瘤细胞的异质性
作者首先通过检索到的scRNA-seq和bulk RNA-seq数据，分别分析了肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞的肿瘤间和瘤内异质性。在肿瘤细胞中，从单细胞水平上发现血管生成、细胞干性和EMT高度相关，并鉴定出同时高表达的细胞亚群。作者推断在TNBC中发现的这三个信号之间很强的相关性可能会导致TNBC中更多的转移表型和更高的复发率。
（2）TNBC细胞中的免疫细胞异质性
作者通过UMAP降维分析，将免疫细胞分成了三个簇(T细胞、B细胞和巨噬细胞)。在TNBC中，T细胞浸润表现为瘤间和瘤内异质性。许多检查点分子，如TIGIT和LAG3，在一些T细胞中高表达，这可能是检查点阻断治疗的靶点。M2型TAMs在TNBC中明显上调。对于肿瘤浸润的B细胞，作者分析了B细胞的功能状态，如抗凋亡、幼稚记忆、细胞因子、促凋亡、增殖、生发中心和相关基因表达特征。B细胞在TNBC患者之间和同一TNBC患者内表现出不同的活性分布。
在TNBC肿瘤组织的巨噬细胞中，M2型TAMs的典型基因信号如MS4A6A和PLAUR异常表达。巨噬细胞中显著表达的基因也参与炎症和血管生成功能。TGFBI、MS4A6A和CD163等M2型基因在TNBC的大多数巨噬细胞中表达上调。此外，已知的促进血管生成、EMT和肿瘤进展的基因，如IL8和PLAUR，在TNBC巨噬细胞中过表达。从与B细胞、T细胞、巨噬细胞、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞相关的基因组的GSVA富集分数显示，M2型巨噬细胞占TNBC中总巨噬细胞的比例很高。总体而言，M2型TAMs是TNBC中的主要巨噬细胞类型。
（3）M2型TAM与TNBC患者的低生存率相关
利用TCGA TNBC患者的bulk RNA-seq数据的转录组图谱，作者探索了M2型TAM密度与RFS之间的关系。生存分析及Cox比例风险回归模型显示，TAMS的高丰度与TNBC患者较差的无复发生存期(RFS)相关。
为进一步了解TAMs在TNBC中的潜在作用，作者利用WGCNA分析鉴定TAM相关的gene signature。作者先筛选出与M2型TAM得分相关性最高的“TAM模块”，然后在TAM模块中找到的hub基因，之后对hub基因进行单变量Cox比例风险模型和回归分析筛选出TAM相关gene signature。
最后，作者根据来自GEO数据库的数据集，利用COX回归分析和SsGSEA分析验证了TAM相关gene signature预测TNBC患者RFS的能力，并且发现TAM相关gene signature与代谢之间存在负相关，这暗示了TAM与TNBC代谢变化之间的潜在关联。
（4）TAM相关gene signature的分子分类
根据TAM相关gene signature的表达模式，将TNBC患者分为不同的亚组。热图显示了两个簇之间的差异表达基因。生存分析显示这两组患者具有不同的RFS结果和M2型TAM密度，这进一步证实了M2型TAM与TAM相关gene signature之间的关联。
（5）M2型TAM相关基因预测免疫治疗反应
作者通过两种常用的机器学习方法--随机森林和支持向量机，寻找gene signature中与TAM密度最相关的基因。结果发现VIPR1、ABCD4、SLC40A1和SCNN1A等几个基因是预后不良的因素，并且这四个基因参与代谢变化，进一步说明了TAM与TNBC代谢变化之间的潜在关联。最后，作者将TCGA TNBC数据集作为训练集，建立了一个基于神经网络的模型，通过TAM相关gene signature预测免疫治疗的反应，并用GEO数据集作测试集来评估准确度。这些结果强调了M2型TAMs在TNBC治疗中对免疫治疗效果的重要性。
05
总结
研究结论：
（1）确定肿瘤细胞和免疫细胞群体都是TNBC中肿瘤间和瘤内异质性的来源。
（2）在单细胞水平上，EMT、血管生成和细胞干性之间存在高度的相关性。
（3）在TNBC患者中，M2型TAM与无复发生存（RFS）相关。
（4）作者构建了一个M2型的TAM相关gene signature来预测TNBC患者的RFS。
（5）通过支持向量机和随机森林算法发现了几个与M2类TAM评分高度相关的基因。
（6）M2型TAM相关gene signature建立神经网络来预测免疫治疗反应。
研究局限性：
（1）TAM相关基因签名的临床价值需要在前瞻性设计的临床试验中进一步验证。
（2）应该进行大型、设计良好的前瞻性人群研究，以调查TAM的复杂作用，并验证TAM相关gene signature的结果。
（3）TNBC中TAMS、EMT、血管生成和细胞干性之间的潜在串扰和分子相互作用需要进一步的实验研究。