腺相关病毒常见问题解答

Q1：AAV的注射方式，有尾静脉注射也有局部原位注射，该怎么选？

AAV的体内注射（给药）方式分为系统性给药和局部给药，系统性给药主要有尾静脉、颈静脉、眼眶静脉和腹腔静脉给药；

局部给药方式常见的包括脑立体定位、肌肉定点注射、心肌原位注射、玻璃体腔内注射、关节腔注射等；

系统性给药是特点是病毒注射的体积较大，一般需要100~1000μl不等，病毒在体内扩散的范围广，一般系统性给药的方式操作较为简单，给药比较方便；

局部给药则病毒注射量要求较少，一般100μl以内，但对滴度要求较高；由于是直接将AAV递送到目标组织，局部给药会有更好的靶向性，如果是临床基因治疗，局部给药注射的病毒量少，因此病理毒性会更小。

Q2：AAV注射小鼠，多少病毒量才够呢？

影响AAV注射总量的因素很多，比较重要的有血清型、目标组织类型、注射方式（局部or全身）、动物模型（如大鼠or小鼠）等，对于有文献报道的，可参考文献的注射方法，最好设置几个不同的梯度。例如AAV9感染小鼠心脏组织（心肌细胞），可采用尾静脉注射也可采用心肌多点注射的方式，尾静脉注射推荐1011 vg/mL，100μL；原点注射则推荐1010 vg/mL，20 μL/点。

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Q3：AAV注射后多久起效？有办法缩短其表达时间吗？

在我们的上期有提到，AAV进入细胞后需经历一个从单链DNA变成双链DNA的过程，因此，目的基因开始表达所需的时间较长，一般在1周左右或以上可以检测到，这个也跟目的基因相关，不同基因的表达高峰时间是不同的。

另外，可采用自互补AAV（Self-complementary Recombinant Adeno-Associated Virus ，scAAV）加快表达速度，scAAV是通过改造其中的一个ITR使得AAV可形成二聚体，其进入细胞可直接进行表达，在多种组织中表达更迅速且表达水平更高。但缺点是，scAAV的包装容量进一步缩小，约为AAV的一半，因此只能用于基因片段较小的研究。

Q4：AAV体内注射纯化的目的是什么？

如果是用于体外感染细胞的病毒，一般不用纯化，但对于用于注射至体内的病毒，无论是慢病毒还是AAV，均有必要进行纯化。这是由于病毒在包装生产过程中，未经纯化的病毒液含有大量的病毒外壳、细胞（293T）内毒素、破损颗粒、及细胞碎片等，这些物质如果随病毒一起注射到动物体内，可能会引发强烈的免疫反应，从而影响动物的生存状态。另外病毒纯化也是一个浓缩的过程，有利于后续的稀释使用。

Q5：为什么AAV是目前基因治疗领域最热门的载体？

这是因为AAV具备以下优势：

1、宿主范围广：分裂和非分裂细胞；

2、安全性高：未发现致病AAV；ITR和rep/cap独立质粒表达；

3、免疫原性低：对动物或人体造成的免疫反应小，几种病毒载体中相对最小；

4、靶向性好：多种血清型，组织特异性。

但目前AAV并不是完美的，仍有许多需要优化和改进的地方，如特异性还有待提高，从而减少AAV的使用剂量，降低毒理风险；通过载体改造提升载体容量，解决较大片段基因治疗的问题；另外还需要开发更多具备不同功能的AAV，如跨血脑屏障、跨突触等。