科研 | Food & Function：金荞麦花粉多糖可减轻抗生素引起的肠道菌群失调并改善肠道屏障...

编译：逍遥君，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

抗生素是临床最常用的抗感染药物，但也可破坏正常的肠道微生物，引起肠屏障功能障碍。为了阐明金荞麦（Fagopyrum esculentum Moench）花粉水溶性多糖（WFPP）对抗生素处理小鼠肠屏障完整性的影响和机制，将BALB/c小鼠暴露于广谱抗生素（头孢曲松NR）或不暴露于广谱抗生素（对照），并每日经口灌胃给予低、中、高剂量WFPP（分别为100 mg/kg、200 mg/kg和400mg/kg），连续3周。

结果发现，接受头孢曲松治疗的小鼠表现出生长迟缓、胸腺和脾脏等免疫器官萎缩、肠道通透性增加和肠屏障损伤的症状，经不同剂量的WFFP干预后恢复。而且，WFPP的有益作用与肠道sIgA分泌增强和炎症反应减少密切相关。进一步的16S rDNA基因测序发现，WFPP提高了微生物多样性和丰富度，改变了群落结构，因此，缓解了头孢曲松引起的微生物群微生态失调。结果表明，WFPP可以通过增加肠道sIgA分泌和抑制炎症，缓解抗生素引起的菌群微生态失调以改善肠道屏障完整性。

论文ID

原名：A polysaccharide from Fagopyrum esculentum Moench bee pollen alleviates microbiota dysbiosis to improve intestinal barrier function in antibiotic-treated mice

译名：金荞麦花粉多糖可减轻抗生素引起的小鼠肠道菌群失调，并改善肠道屏障功能

期刊：Food & Function

IF：12.121

时间：2020.11

通讯作者：范亚苇 & Liufeng Zheng

通讯作者单位：南昌大学食品科技国家重点实验室

实验设计

本文对WFPP进行提取和结构表征，对头孢曲松导致的肠道菌群失调小鼠补充WFPP进行干预，通过比较WFPP干预组与未干预组小鼠血清生化指标、肠道通透性结肠组织、胸腺等免疫相关脏器、肠道sIgA和炎性细胞因子的变化，在表观层面验证了WFPP的生物学功效，此外通过16S rDNA测序对肠道菌群的结构和变化进行表征，并用代谢通路预测探究和建立了WFPP修复抗生素引起的肠道菌群失调及并发症的生物学机制。

主要内容

1 WFPP的初步特性鉴定

WFPP中总碳水化合物、糖醛酸、蛋白质和多酚的含量分别为60.69±0.43%、12.23±0.54%、1.44±0.23%和0.41±0.03%。WFPP的单糖GC色谱图及其组成如图1所示，WFPP主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，三种单糖的总含量可达92.52%，含有少量的鼠李糖、木糖和甘露糖。WFPP中鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的质量比为2.84：34.57：1.69：1.12：27.11：30.84。

图1 WFPP单糖结构。（A）GC色谱图。（B）单糖组成。

2 WFPP对生长及血清生化指标的影响

如表1所示，与C组相比，NR组的最终体重、体重增加和摄食量较低。然而，WFPP经口干预后，C组和3个WFPP组的最终体重和体重增加无显著差异。与NR组相比，3个WFPP组的摄食量略有增加，但与C组相比仍明显减少。这些结果表明，抗生素可能损害动物生长，WFPP干预可使其恢复。此外，与C组相比，3个WFPP组的WFPPL中TC和TG含量明显降低。而各组其他血清生化指标均无明显变化。

表1 WFPP对生长、血清生化指标、肠道通透性、免疫功能的影响。

3 WFPP对肠道通透性及免疫相关脏器的影响

测定血清中LPS和肠黏膜MUC2的含量，探讨WFPP对CEF处理小鼠肠道屏障功能的有益作用。如表1所示，MUC2表达不受CEF处理或WFPP干预的影响。与C组相比，NR组LPS含量显著升高，但C组与WFPPM组或WFPPH组无明显差异。结果表明，补充中或高剂量的WFPP可降低CEF处理小鼠血内毒素水平，从而改善肠屏障功能。NR组胸腺和脾脏指标最低，均较C组急剧降低，表明CEF治疗后胸腺和脾脏萎缩。与NR组比较，不同剂量WFPP灌胃使胸腺、脾脏指标急剧增强，恢复到C组水平。结果表明，WFPP能修复CEF对小鼠免疫器官的损伤，恢复免疫器官的生长发育。

4 WFPP对CEF诱导的结肠组织学变化的影响

通过H&E和AB-PAS染色获得结肠组织切片，进一步研究WFPP对CEF处理小鼠肠道屏障完整性的有益功能。如图2A所示，C组结肠上皮细胞排列紧密有序，有大量结构良好的隐窝，绒毛长而清晰。而CEF组结肠黏膜溃疡；隐窝结构受损；上黏膜变形；炎性细胞严重浸润；绒毛变短、不规则；上皮屏障变形。NR组和WFPPL组肠黏膜溃疡和隐窝破坏均有一定程度的减轻；黏膜与黏膜下层间隙明显缩小；细胞炎性浸润仍存在但有改善。WFPPM组和WFPPH组结肠黏膜趋于正常；细胞结构排列有序；炎性细胞浸润基本消失；隐窝结构基本恢复正常；绒毛长度与C组相似。通过定量结肠绒毛长度、隐窝深度和绒毛/隐窝比证实了这些观察结果，如图2B所示。此外，通过显微镜观察了结肠组织切片中肠杯状细胞和粘液的表达，结果如图2 C所示。CEF组杯状细胞和黏液面积较C组过度减少。WFPPM组和WFPPH组的杯状细胞和粘液面积显著升高，恢复到C组的水平。提示WFPP干预对CEF引起的损伤肠黏膜有良好的修复作用。

图2 WFPP对CEF诱导的结肠组织学变化的影响。（A）HE染色进行肠组织学评价。（B）绒毛长度、隐窝深度和绒毛/隐窝比。（C）AB-PAS染色进行肠组织学评价。放大倍率，×200。

5 WFPP对肠道sIgA和炎性细胞因子的影响

检测肠道sIgA的含量，明确WFPP改善CEF治疗小鼠肠道屏障功能的机制。如图3所示，CEF处理显著降低了肠道sIgA含量，通过不同剂量的WFPP干预，均恢复至C组。停止CEF治疗后，NR组sIgA分泌升高，3个WFPP组的sIgA含量与NR组相比在数值上增强，但差异均无统计学意义。

图3 肠黏膜中sIgA的浓度。

炎症会损害肠道屏障功能，因此比较了WFPP对CEF处理小鼠肠粘膜中主要炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）分泌的影响（图4）。给予CEF（CEF和NR组）可显著增强肠道IL-6和IL-1β表达，通过低、中、高剂量WFPP干预均可恢复到C组水平。各组TNF-α浓度差异无统计学意义。综上所述，WFPP可诱导sIgA分泌，减少细胞因子（IL-6和IL-1β），有助于减轻CEF引起的肠道屏障损伤。

图4 肠粘膜中TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β（C）的浓度。

6 WFPP对CEF小鼠肠道菌群的影响

从盲肠样本中共获得2916196个16SrDNA序列，平均每只小鼠97210个序列。根据97%以上的相似性定义了293个OTU。如图5A所示，CEF组的OTU数量仅为31，与C组相比显著减少（221）。停止抗生素治疗后，NR组OTUs数（146）增加，但仍明显低于C组。WFPP干预后，WFPP组OTUs数明显增加，即WFPPL组、WFPPM组和WFPPH组分别为139个、177个和205个OTU，其中WFPPH OTUs数基本恢复至C组。通过QIIME分析肠道菌群的β-多样性，比较不同样本在物种多样性上的相似性（图5B-5D）。PCoA、PCA和NMDS分析显示，C、NR和WFP组大部分样本与CEF组分离，WFPH组与C组有明显的相似性。通过对OTU水平的Heatmap和UPGMA的分析，揭示了6组微生物群落的异同（图5E和5F）。热图和UPGMA分析显示个体间存在高度差异。总的来说，WFPPM和WFPPH组与C组组装在一起，而WFPPL和NR组聚集在CEF组中。

图5 微生物群落组成特征。（A）OTU直方图。（B）基于未加权UniFrac距离的非度量维标度（NMDS）。（C）主坐标分析（PCoA）。（D）主成分分析（PCA）图。（E）OUT水平的热图。（F）UPGMA分析。

根据表2，CEF组Chao1、Ace和Shannon指标较C组显著降低，表明灌胃CEF可显著降低肠道菌群的多样性和丰富度，破坏肠道菌群平衡，导致肠道菌群微生态失调。自然恢复一段时间后，NR组肠道菌群多样性和丰富度增加，但仍显著低于C组。WFPP干预以剂量依赖的方式显著提高了肠道菌群的丰度和多样性。更重要的是，WFPPH组的恢复效果强于其他两个WFPP组，其中WFPPL组的指标与NR组相似，WFPPH组与C组相似。

表2 α多样性指数分析

7 肠道菌群在门、属和种水平的组成

门分布结果如图6A所示，所有样本共定义了10个门。拟杆菌门和厚壁菌门是6组中的主要细菌。CEF组厚壁菌门丰度增加，占89%，拟杆菌门、Epsilonbacteraeota和变形菌门的相对丰度分别占0.15%、0.0012%和0.0014%。停用CEF后NR组菌群失调略有恢复；厚壁菌门丰度降低（36.10%）；拟杆菌门含量升高（35.30%）；厚壁菌门/拟杆菌比例基本恢复正常；菌群多样性增加，但植物区系的丰度和多样性仍低于C组。WFPP处理后，厚壁菌门/拟杆菌门的比值进一步恢复。WFPPL组、WFPPM组和WFPPH组的疣孢霉含量分别为7.04%、8.91%和0.43%，与NR组（20%）相比有所减少。在属水平上（图6B），所有样本中定义了87个属。CEF组的菌群主要由肠球菌（59.14%）和uncultured_bacterium_f_Clostridiales_vadinBB60_group（19.47%）组成，其他肠道菌群含量显著降低，表明肠道菌群平衡被打破。停用CEF 3周后，NR组肠球菌科和Clostridiales-vadinBB60的丰度基本恢复正常水平；大部分被CEF抑制的细菌有所增加。WFPP干扰后，几乎所有被CEF抑制的细菌丰度均增加。更重要的是，WFPPH组细菌组成接近C组。此外，中、高剂量WFPP干预可抑制NR组异常增加的菌群丰度，WFPPH的抑制作用优于WFPPM。在种水平（图6C），所有样本共定义了92个种属。CEF组肠道菌群主要由bacterium_Te59R和uncultured_bacterium_f_Clostridiales_vadinBB60_group组成（分别为59.14%和19.47%），而其他菌群比例急剧降低。NR组bacterium_Te59R（0.048%）和uncultured_bacterium_f_Clostridiales_vadinBB60_group（0.018%）比例基本恢复正常水平；CEF抑制的肠道菌群大部分增强。WFPP处理后，正如预期的那样，3个WFPP组，尤其是WFPPH组大多数微生物群的丰度均恢复到正常水平。基于上述，抗生素破坏了肠道菌群的组成和多样性，而WFPP可以有效修复抗生素引起的肠道菌群紊乱。

图6 肠道菌群差异。门（A）、基因（B）和物种水平（C）肠道菌群的相对丰度。（D）LEfSe分布直方图。（E）各组的枝形图。

8 WFPP调节肠道微生物组的特定系统发育型

进一步进行LEfSe分析，鉴定不同组肠道菌群有统计学意义的生物标志物。线判别分析（LDA）评分分布直方图和Cladograms如图6D和6E所示。所有组中共有85例OTU存在显著差异。C组有29个OTUs；CEF组有9个OUTs差异显著；NR组有10个OUTs；WFPPL、WFPPM和WFPPH组分别有11、4和7个OUT。WFPPL中的拟杆菌目及其门、纲、属、种丰富，差异显著。f_Muribaculaceae及其属和种在WFPPM中表现出明显的差异，但o_Bacillales、f_Staphylococcaceae及其属在WFPPH中存在显著差异。

9 微生物群落KEGG代谢通路分析

如图7所示，与C组相比，CEF组和WFPPM组有39条代谢途径发生了显著变化。此外，KEGG分析强调了C组和CEF组之间的显著改变，其中cell motility, global and overview maps以及核苷酸代谢明显减少，而复制和修复、脂质代谢、碳水化合物代谢、膜转运和氨基酸代谢增强。WFPP干预后，肠道菌群的大部分功能能力已恢复到C组的标准。因此，WFPP干预有利于肠道菌群代谢功能的差异。

图7 PICRUSt预测的肠道微生物群落功能。分别为C和CEF（A）、C和WFPPM（B）以及CEF和WFPPM（C）相关的微生物群落的推断功能差异。C，对照；CEF，头孢曲松；WFPPM，200 mg/kg WFPP。

结论

金荞麦（Fagopyrum esculentum Moench）蜂花粉多糖因其潜在的健康促进作用而受到广泛关注。正常肠道黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障四部分组成，其中机械屏障是最重要的组成部分。

本研究发现CEF可使结肠黏膜结构破坏；绒毛长度缩短；杯状细胞和黏液面积明显减少。还可引起肠道通透性增加，细菌内毒素和炎症介质血清LPS浓度升高。CEF引起的这些损伤被WFPP干预逆转，表明WFPP可以改善肠道屏障完整性。sIgA是一种非炎性抗体，主要用于粘附大分子的病毒、细菌、抗原和有害物质，表现出肠道屏障功能的保护作用。给予高剂量WFPP可以大幅增加肠道sIgA的分泌。同时，WFPP处理后变形菌门的相对丰度明显增加。提示WFPP可通过上调变形菌门等一些特殊肠道菌群的丰度刺激sIgA分泌。CEF处理小鼠的血清LPS以及肠道IL-6和IL-1β水平显著升高。同时，与C组相比，CEF组肠球菌的丰度显著增加。WFPP干预后，IL-6、IL-1β、LPS、肠球菌的水平恢复到正常水平，提示WFPP可以通过下调肠球菌等一些特殊肠道菌群的丰度来抑制肠道炎症。本研究验证了WFPP可以促进有益菌的生长，抑制有害菌有效缓解肠道菌群微生态失调，从而改善抗生素处理小鼠的肠道屏障功能。

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