人结肠组织上皮细胞悬液制备

本protocol仅供参考,还请根据自己的组织和实际的实验设计进行相应的替换

背景介绍

结肠是大肠的一部分,主要功能是吸收水分和电解质,将食物残渣形成粪便。结肠组织学结构包括黏膜、黏膜下层,肌层和外膜。黏膜表面光滑无绒毛,上皮为单层柱状,由吸收细胞和杯状细胞组成;黏膜下层则是结缔组织,含成群脂肪细胞;肌层由内环形和外纵行两层平滑肌组成,可形成结肠袋;外膜为浆膜或者是纤维膜。

在本实验中使用到的TrypLE™ Express 是一种非动物源性重组酶,用于各种粘附状态下的哺乳动物细胞,包括 CHO、HEK293、A529、角质形成细胞和胚胎干细胞。TrypLE™ Express 裂解赖氨酸和精氨酸 C-末端上的肽键,可直接替代胰蛋白酶,特异性高,细胞损害小。

结肠组织图片及示意图

实验仪器及耗材

转移培养基(500 mL)

  • DMEM(高葡萄糖)500mL+青霉素/链霉素5mL+HEPES 5mL(1M)

HPGA (500 mL)

  • HBSS 500 mL +青霉素/链霉素5 mL+HEPES 5mL(1M)

洗涤培养基(50 mL)

  • HPGA + 1mM EDTA + 1mM DTT

螯合培养基(50 mL)

  • HPGA + 1mM EDTA

实验步骤

  1. 10mL预冷洗涤培养基清洗得到的组织,重复3次。
  2. 清洗后的组织转移到37℃预热的螯合培养基(5mL)中孵育20分钟,每10分钟晃动一下组织。
  3. 去上清,将组织转移到5mL预热的螯合培养基中,37℃孵育10分钟。
  4. 震荡2次,每次5秒。
  5. 解离组织自然沉淀,取上清,剩下的组织再加入5mL预热的螯合培养基,37℃孵育。
  6. 收集到的上清液如果有隐窝存在,则4℃,300g离心4分钟。
  7. 使用2mL转移培养基重悬隐窝,冰上保存。
  8. 重复步骤3到步骤7,尽可能收集隐窝,重复至多4次。
  9. 隐窝悬浊液,4℃,400g离心4分钟。
  10. 用3mL预热的TrypLE Express(含50μg/mL 脱氧核糖核酸酶I)重悬。
  11. 37℃孵育45分钟,摇动或者晃动都可。
  12. 用含5%血清的3mL转移培养基终止。
  13. 用70μm细胞过滤器(用血清润洗)过滤到50mL离心管中,用5mL转移培养基+5%血清冲洗细胞过滤器。
  14. 除去过滤器,用含5% 血清的15mL转移培养基清洗。
  15. 300g离心4分钟。
  16. 去除上清。用10mL洗涤培养基清洗沉淀。
  17. 300g离心5分钟。
  18. 非常小心地取出上清(不要碰到沉淀颗粒),直到剩下1mL。重悬沉淀。
  19. 用40μm细胞过滤器(用血清润洗)过滤,用5mL PBS + 0.04% BSA冲洗。
  20. 300g离心5分钟,去上清至小于1mL,重悬沉淀后用PBS +0.04% BSA补到1mL。
  21. 通过细胞计数仪检测细胞活性大于等于85%,背景干净,结团率小于5%,细胞量大于等于5万;可用于后续单细胞测序建库实验。

制备结果

注意:结肠组织脂肪含量高,要多清洗,清洗不完全会干扰细胞计数,严重会影响细胞捕获。解离过程中容易结团,一定要充分消化。另外,结肠组织代谢比较旺盛,解离的时间和酶的强度把握不好的话,活率容易偏低,即使合格了最后下机数据可能线粒体偏高。
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