【衡道丨干货】免疫组化中的双染色技巧
免疫组织化学（Immuohistochemistry，IHC）为探讨组织或细胞内蛋白常见的方法，利用抗体与抗原结合找到所需要的蛋白座落的地方，然而为了可以在同一个组织或细胞找到两个标的蛋白表现或结构（图一），或者是在同一组织中观察不同的细胞型态，双染的技术（Double stain）相对重要，不但可以节省样本数量与准备时间，也可有效节省经费之花费。
双染色为可以在同一个样本中进行两个抗原的定位与检测，跟荧光方式最大的不同为不需要结合（合并）图片，肉眼即可发现两个蛋白颜色之不同，且可以永久保存，不用担心信号降解之问题。
双染跟传统的组织染色流程相似，利用一样的显色方式与试剂，但其实要在同一个样本中，呈现两个不同颜色蛋白其实没那么容易，其中的阻断剂（blocking buffer），显色剂（substrate），抗体等试剂可都是有很高深的学问在里面的，例如AP呈现系统中，含有磷酸根的试剂都必须避免，减少信号之干扰。
图一：右图为人类视网膜内皮细胞免疫组织染色，左图为人类扁桃腺免疫染色。
Blocking
双染时必须特别注意封闭的步骤，避免非专一性的结合信号干扰，尤其是二级抗体（二抗）要辨认一级抗体（一抗）的步骤，常会发生有杂讯干扰的现象发生，因此封闭的步骤更显得重要。除此之外，封闭也是降低背景值的关键。高背景值常为IHC会遇到的问题，其干扰的信号来源主要为组织内源性酵素（endogenous enzymes）或是抗体Fc端的非专一性结合所导致。
在双染的实验下，可以选择不同的显色系统，但常见的还是选择同一个显色系统，只需要选不同色即可。但也因为都是同一的系统，因此适合的Blocking buffer与专一性高的抗体为重要之课题，根据不同的需求选择合适的blocking更为重要。
Blocking/Inactivating Enzymes
内源性的过氧化酶 (peroxidases) 与磷酸酶 (phosphatases) 与显色剂 (substrate) 结合为导致高背景的主因，有效抑制过氧化酶与磷酸酶活性可达到降低背景值之要求。
不同显色系统选择的显色剂也不同，levamisole分子可有效抑制磷酸酶活性。然而在肠道组织中的磷酸酶则不受到levamisole抑制，不过有些厂商的广谱性产品即使遇到对于levamisole 有拮抗性的磷酸酶，还是能够有效抑制其活性。
另一些产品可有效抑制内源性的过氧化酶。有些实验会建议使用过氧化氢 (H2O2) 来阻隔内源性的HRP作用，但最常面临到的问题是实验过程中产生的气泡破坏原组织结构，即使将 H2O2 溶在甲醇中可以改善气泡的产生，但却易导致抗原被破坏，导致单株抗体无法辨认结合，种种因素导致现在越来越多研究者选择商品化的blocking buffer。
在双染IHC 的实验中，因为会使用两只 HRP 标定的抗体，在加第二只 HRP 标定抗体前，必须确认第一只 HRP 抗体的酵素活性失活，避免残留的 HRP 活性影响到后续的信号，此时尤其需要在不伤害抗原结构的前提下使第一支抗体上的 HRP 失活。
Blocking General Nonspecific Binding
通常为了增加组织贴附性，玻片上会经过一些表面处理，像是Poly-D-Lysine处理，然而这样的处理虽然可以增加贴附，但是在没有组织的区域也容易导致非专一性蛋白结合，此外抗体也可能会和组织形成非专一性结合影响到后续的判读。
在免疫细胞中的FCγ受体也有可能会造成高背景的现象，主要是因为FCγreceptor对于IgG结合力都不相同，然而高亲和性与低亲和性IgG结合力所使用的封闭方式也有所不同。如果组织中为低亲和性的FCγ受体就比较不用担心，只要增加清洗试剂培养的时间即可破坏其键结；但如果是高亲合性的FCγ受体即较为棘手，因为对于IgG的结合力比较强，因此只靠清洗试剂无法将非专一性的结合去除，血清或是未标记的IgG可以有效减少专一性的结合。10％BSA稀释剂/封闭液（＃50-61-00）或是10％血清最常被拿来使用抑制非专一结合；少量的洗涤剂存在，例如0.05％Tween 20溶在阻塞缓冲区或是清洗试剂也可以改善非专一性结合的问题。
Choice of Antibodies
免疫染色一直都是研究的潮流，陆续都有许多抗体公司研发IHC专用抗体去迎合市场，除了一级抗体外，辨认一级抗体的二级抗体更是关键，大都是多株抗体，最大的好处为可以增加信号，但多株抗体最常遇到的问题为不同物种间的交叉反应（cross-reactivities），因此即使是二抗，最好也要通过不同物种间的血清吸附反应，减少交叉反应的发生。
有的大厂为了严格管控二抗的品质，会经过10道纯化手续步骤（图二），包含正筛选IgG外，会再通过负筛选，将构型相似的IgM或IgA去除后，再进行后续的过滤包装，这样繁杂的手续可以让背景值降到最低，且专一性与稀释倍数高，更有些抗体会通过血清吸附之实验，减少物种交叉反应之发生。反之如果只经过3-4道纯化手续的粗糙手法，容易有杂讯的产生，往往会影响后续的实验。
图二
Biotinylated Antibodies
如果两只一级抗体皆来于同一物种时，没有办法利用二级抗体去做双染的实验，主要原因是二抗为辨认一抗之物种，如果一级抗体的物种相同时则无法分辨为哪一只抗体之信号，因此如果实验遇到这样的状况，则会建议在其中一只一级抗体后方接上生物素（Biotin），这样就可以利用Biotin会与链霉亲和素（streptavidin）结合的特性去区分，所以其中一只的二级抗体为要选择Streptavidin接上HRP或是AP酵素即可做后续显色的实验。如果是这样的做法的话，未标定的一抗要先检测，之后再阻止掉非专一性的结合，后续再加入另外一只有标定biotin的一级抗体即可。
当然除了Biotin- streptavidin的方式，也有其他替代方案，例如选择FITC标定一级抗体，那二抗选择anti-FITC即可。
HRP与AP为IHC中最常被使用的酵素，AP系统的好处为可以较长时间表现信号，但过度冗长的显色也会导致高背景值的发生，通常不建议超过10-20分钟。双染的实验中，也可以搭配其它合适的产品抑制内源性的HRP酵素活性，可以增加约两倍的信号值但不会增加背景值。
Whole Antibody vs. Fab vs. F(ab’)2
市面上的抗体除了有全IgG，也有不同的同种型，像是Fab或是F（ab'）2，两者的差异在于中间是否有双硫键的结合。如果样本是淋巴系统或是其他免疫系统的话，因为要考虑Fc receptor的问题，F（ab'）2与Fab为不错的选择，且他们的分子小，也比较容易渗透入福马林固定的组织中。但因为他们制造过程较繁复，所以抗体的价格会较高。
Choice of Substrates
为了能够分辨出不同的目标蛋白，要避免相同色系或是吸收光谱。HRP系统常见的基板为DAB，为棕色沉淀，其产物非常稳定，适合做双染的选择。AP系统不如HRP系统普及。
Counterstains
Counterstains为染细胞核的染剂，目的是确认细胞位置，为染背景值的方式，在选择上只要颜色没有跟其他显色剂重复即可。当然此染色取决于实验需求，并非必须的程序。
了解更多衡道病理资讯，欢迎访问官网：https://www.histomed.com