从典型论文学习发SCI：样本量99例的研究发表在了IF 8.77的期刊上

本文转载自公众号“Hanson临床科研”，由李博士撰稿，Mark点评。

本次我们以Neurology的一篇论文为例，分享主题为“F因素与D疾病的P预后”。

这篇论文题为“Lipids, apolipoproteins, and prognosis of amyotrophic lateral sclerosis”（血脂、载脂蛋白和肌萎缩侧索硬化的预后）于2020年发表在神经病学顶刊Neurology杂志(IF 8.77)。

之所以解析这篇论文，是因为这篇论文仍然有以下特点：

• 课题设计简单；
• 观察的是血脂和载脂蛋白都是临床常见指标；
• 样本量也不大，仅99例；
• 临床医生即可以完成；
• 却发表在神经科顶刊。

我们一起学习，作者是怎么做到的。

一、研究背景（立项依据）

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophiclateral sclerosis, ALS）被认为是一种系统性疾病。越来越多的证据表明，ALS中的能量代谢失调可作为临床治疗干预的目标。

已有研究报道，

（1）总胆固醇（TC），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），甘油三酸酯（TG）和LDL-C /高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平升高在ALS患者中更为普遍，尽管结果并不总是一致的。

（2）根据全基因组关联研究（genome-wide association studies, GWAS）和孟德尔随机分析，已找到血脂异常和ALS存在因果关系的证据。

表1. 脂代谢与ALS预后的总结

瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡大学医院神经病学诊所针对其诊断的99名ALS患者，进行了队列研究，目的在于确定脂质和载脂蛋白是否可用于预测ALS患者的预后。

二、论文设计图

三、研究方法

1，研究对象

这项研究纳入了于2015年9月至2018年10月，在瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡大学医院神经病学诊所确诊的99例ALS患者（包括2例进行性脊髓性肌萎缩患者）。从诊断之日至死亡或至2018年10月31日，所有患者均通过瑞典运动神经元疾病登记处进行了单独随访。

2，信息采集

获取患者性别，出生日期，症状发作年龄以及部位，确诊年龄，确诊BMI以及确诊时ALSFRS-R得分信息。

定义：

“诊断延迟”：症状发作时间与确诊日期间的时间间隔（以月为单位）；

“进展率”：（48-确诊时ALSFRS-R得分）/ 诊断延迟。

总生存时间的计算方法：死者诊断日期与死亡日期之间的时间间隔，或与研究结束之间的时间间隔（针对截至2018年底仍存活的患者）。

此外，通过瑞典运动神经元疾病登记处与其他118例ALS或PSMA患者信息进行比对，对研究样本的代表性进行评估。

3，检测项目

卡罗林斯卡大学医院实验室对所有确诊患者，在其诊断时或不久后，对空腹新鲜血液样本进行检测，主要项目涉及：TC，LDL-C，HDL-C，LDL-C/HDL-C比值，TG，ApoAI，ApoB和ApoB/ApoAI比值。

其中87例（87.88％）患者在诊断后2个月内再次检测。

4，统计学分析

脂类和载脂蛋白与诊断后死亡风险的关联使用Cox比例风险回归模型，通过风险比及其95％置信区间（CIs）进行评估。

在这些模型中，针对性别（男性vs.女性），诊断时的年龄（连续变量），症状发作的部位（延髓vs.非延髓），诊断延迟（连续变量，以月为单位），诊断时的BMI（连续变量），诊断时的ALSFRS-R得分和进展率进行调整。自诊断以来的时间用作基础时间标度。由于并非所有患者在诊断时都进行了血脂和载脂蛋白的精确测量，因此对所有生存模型进行调整，将其在实际采血时延迟输入，以诊断日与采血日之间的时间间隔计算（以月为单位）。

主要分析流程：

（1）将研究的生物标志物用作连续变量，并评估了每种生物标志物每增加一个标准差（1-SD）对ALS诊断后死亡风险的影响。

（2）根据这些变量的四分位数对这些变量进行分类，并估计了生物标志物每四分位数增加对ALS诊断后死亡风险的影响。

（3）使用基于Schoenfeld残差的统计数据检查了Cox模型的比例风险假设。注意到症状发作部位和进展率（p < 0.1）的假设略有偏差，而其他变量则没有。

（4）在用这两个协变量对Cox模型进行分层后，其他变量的风险比与未进行分层的模型所产生的风险比几乎相同。为了简化和保持一致，而不对这两个变量进行分层。

（5）在主要分析中，忽略了少数缺少数据的患者；在第一次敏感性分析中，通过标准碳酸氢盐对分析进行了调整，在其他一些敏感性分析中，将缺失的数据替换为最低的第25个百分位数，整个队列的平均值或第25个百分位数的最高值，并将敏感性分析的结果与主要分析的结果进行比较。在另一项敏感性分析中，将分析仅限于诊断后1个月内测得的脂质和载脂蛋白患者，以评估延迟采血对结果的影响。

（6）此外，完成了仅限于ALS患者的敏感性分析，因为在先前的主要分析中同时包括了ALS患者和2例PSMA患者。

（7）使用自症状发作以来的时间（而不是自诊断以来的时间）作为基础时间量表进行了另一项敏感性分析，以评估不同时间量表对研究结果的潜在影响。

（8）为了证明特定生物标志物的高水平与低水平相比有相对的死亡风险，作为次要分析，将TC，HDL-C，LDL-C，ApoAI，和ApoB置于最低的第25个百分点；而将LDL-C/HDL-C比值，TG和ApoB/ApoAI比值置于最高的第25个百分点。

（9）特定生物标记物水平高于临界值的患者被归为具有较高生物标记物水平的患者；水平低于临界值的患者被归类为水平较低的生物标志物。Kaplan-Meier生存曲线用于比较研究的生物标志物高低水平患者之间的中位生存时间，时序检验（log-rank tests）用于评估曲线间差异。

（10）根据Cox模型计算接收者操作特征曲线（receiver operator characteristic curves, ROC曲线）下的面积，以选择具有最大潜力来改善ALS预后预测的生物标志物。

（11）最后，根据上述分析结果，结合性别，诊断时的年龄（低于或高于平均值），症状发作部位，诊断延迟（低于或高于中位数），BMI（低于或高于中位数），ALSFRS-R得分（低于或高于中位数），进展率（低于或高于中位数）以及所选的生物标志物（分为高或低）来对ALS患者进行生存预测和分类。

四、主要结果

本研究纳入的99例患者中存在男性52例及女性47例。诊断时的平均年龄为65.72岁，中位诊断延迟为13个月。在诊断时，患者的BMI中位数为24.38 kg/m²，ALSFRS-R得分中值为39，进展率为0.57。这些患者中的绝大多数（91.92％）使用了利鲁唑（见表2）。截至2018年10月31日，已有54名患者死亡，这些患者从诊断到死亡的平均生存时间为13.72个月。

表2. ALS患者的人口统计学特征和临床检测指标

在调整性别、诊断时年龄、症状发作部位、诊断延迟、BMI、ALSFRS-R得分和进展率后，TC，LDL-C，LDL-C/HDL-C，ApoB，ApoB/ApoAI比值或ApoB/ApoAI比值与较低的死亡风险在统计学上显着相关（见表3）。

表3. 在校准性别，症状发作部位，诊断年龄、延迟、BMI、ALSFRS-R得分及进展率后，脂质和载脂蛋白（每增加1个标准差）与ALS诊断后死亡风险相关。

此外，根据生物标记的四分位数分布将其用作分类变量，结果显示出相似的模式（见表4）。

4，在校准性别，症状发作部位，诊断年龄、延迟、BMI、ALSFRS-R得分及进展率后，脂质和载脂蛋白（每四分位数增加）与ALS诊断后的死亡风险相关。

与具有这些低水平生物标志物的患者相比，具有高水平的LDL-C，LDL-C / HDL-C和ApoB的患者在统计学上拥有显着延长的生存期。LDL-C水平高的患者比LDL-C水平低的患者多活13.9个月（中位生存期24.4 vs 10.5个月，p <0.01）；与LDL-C / HDL-C比值低的患者相比，LDL-C /HDL-C比值高的患者生存期延长6个月（中位生存期25.5 vs 19.5个月，p = 0.04）；与低ApoB水平的患者相比，高ApoB水平的患者生存期延长了10.5个月（中位生存期为21.7 vs 11.2个月，p <0.01）（见图1）。

图1. Kaplan-Meier生存曲线

最后，图2展示了ALS诊断后的5种示例性患者的生存情况。

延髓发作的男性患者，诊断年龄≥ 66.92岁，诊断延迟< 12.97个月，BMI< 24.38 kg/m²，进展率≥ 0.57，ALSFRS-R得分< 39，诊断时LDL-C≤ 2.6mmol/L，预测其中位生存时间最短；

而非延髓发作的女性患者，诊断时年龄< 66.92岁，诊断延迟≥ 12.97个月，BMI≥ 24.38kg/m²，进展率< 0.57，ALSFRS-R评分≥ 39岁，且诊断时LDL-C的水平> 2.6 mmol/L，预测具有最长的生存时间。

图2. 生存预测曲线。

五、结果讨论

1，总结

在这篇文章之前，没有脂质和载脂蛋白作为ALS的潜在预后指标的相关研究。

作者对99例ALS患者进行队列研究，结果发现在其他已知的ALS预后指标进行调整后，高水平的TC，LDL-C，LDL-C/HDL-C比值，ApoB，ApoB/ApoAI比值在统计学上与较低的死亡风险显着相关。

2，研究的优势和局限性

本研究的优势包括：

使用在斯德哥尔摩研究期间诊断出的所有ALS患者是具有高度代表性的研究人群，且仅有新发患者入组，诊断时或此后不久对所研究生物标志物进行测量，临床特征的丰富信息，以及分析中所有患者的完整随访。

局限性在于：

（1）包括相对较小的样本量，以及并非所有生物标志物在诊断时都经过精确测量。作者在这项工作中，仅研究了217名有资格参加ALS的患者中的99名。但是，这些患者与其余118例患者在人口统计学和临床特征方面并无明显差异，表明研究样本具有高度代表性。

（2）缺乏对入组患者的基因检测，这遗漏了脂质对已知遗传原因的ALS患者作用的可能性。

（3）由于脂质和载脂蛋白之间的高度统计相关性，在本研究中很难将载脂蛋白的作用与脂质的作用区分开。

3，未来展望（深入研究，课题拓展）

综上所述，本研究虽然有一些局限性，但从另一个角度来看，更是为未来的课题拓展提供了思路。

例如，未来可以进行机理研究，以更好地了解载脂蛋白，尤其是ApoB和ApoB/ApoAI比值，是独立还是与脂质相互作用以参与ALS患者预后。

六、解读

之所以推荐这篇论文，是因为这篇论文与之前的推荐有同样的特点：

A, 可以在其他疾病中复制的论文模板。

B, 临床医生很容易完成。

C, 作者的选题是一个很老旧的课题。

研究很简单、选题也很老旧，还能发3分以上的SCI论文？

论文之所以能够发表，都是因为有First ＆ Last之基础。我们一起看看作者如何从生物指标、疾病、预后三个关键点达到这一要求的。

1），First - 创新性。

说实话，我刚开始看这篇论文和摘要，觉得不可思议。血脂这么老旧的研究指标，还能发Neurology？

如何证明“在这篇文章之前，没有脂质和载脂蛋白作为ALS的潜在预后指标的相关研究。”？

作者做了一个文献回顾，并以表1展现出来。证明，这确实是创新性研究。

2），Last - 严谨可靠。

集中体现在方法学部分，尤其是统计学，把能够做的都做到位。使得该结果就是一锤定音，哪怕只是在一个极小的点上。

本研究中，

1）精确地定义各个观察指标，并且针对是首发疾病的特征，设了随访以再次确诊。

2）做了规范系统的统计分析，砸实了研究结果。规范的统计，是临床科研的关键。

为了方便大家借鉴，我们特意把统计分析的11个步骤都做了解读。

3），遇到审稿人责难怎么办？

选题有创新性、方法学严谨可靠、认真回复审稿人意见，是论文得以发表的三个关键。

对于临床研究，课题设计太容易被抓到纰漏。

我们在这篇论文的最后，看到作者列出了本研究存在三个局限性（后面还加了一个未来展望）。显示了作者投稿及与审稿人交流中的智慧：如果无法解决审稿人的意见，就列入到局限性及进一步研究方向中。

尤其是针对本研究只有99例的质疑，作者做了一个敏感性检验，即这99例与更大样本量没有差别。（我们之前在论文修回稿中，也做过类似的补充）

这个是很好的方法，因为临床研究投稿过程中经常与遇到审稿人提出这个问题“研究的样本量太小”。

研究的样本量无法在扩大了；但是证明其具有代表性就可以了。

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