小分子药物的突围之路（下篇）：蛋白降解剂

If you can’t drug it, degrade it !Breaking down bad-behaving proteins ! 蛋白降解技术以其在突破不可成药靶点、克服现有靶点耐药突变等方面的巨大潜力和优势，吸引了众多科研机构和研发药企的大力投入，也获得了资本的青睐，成为小分子药物突围的一个风口。近期多家专注蛋白降解技术的Biotech公司都获得了资本的大力加持：专注于调控泛素蛋白酶体系统的创新小分子研发的Vividion Therapeutics于6月底递交了IPO申请；“分子胶””疗法新锐Monte Rosa Therapeutics也于6月24日登陆纳斯达克，成功募资2.22亿美元；辉瑞公司与Arvinas于7月22日宣布合作开发和商业化口服PROTAC雌激素受体蛋白降解剂ARV-471，辉瑞将向Arvinas支付6.5亿美元的预付款和超十亿美金的里程碑付款，另外辉瑞还将对Arvinas进行3.5亿美元的股权投资；基于复旦大学鲁伯埙教授团队研究成果发展自噬依赖性降解平台的PAQ Therapeutics于7月16日宣布完成3,000万美元A轮融资。蛋白降解技术逐步完成了从早期偶然发现到理性设计为主导的蜕变，随着研究的进一步深入，我们相信在不久的将来蛋白降解技术将迎来更多突破。真核细胞内蛋白质的降解途径主要有三种，泛素-蛋白酶体（Ubiquitin-proteasome）途径、溶酶体（Lysosome）途径和胱天蛋白酶(Caspase)途径。本文重点对基于泛素-蛋白酶体途径和溶酶体途径的蛋白降解剂在小分子药物“突围”中的巨大潜力与开发现状进行介绍。

一泛素-蛋白酶体途径1.1 泛素-蛋白酶体途径简介蛋白酶体（Proteasome）是在真核生物和部分原核生物中存在的一种巨型蛋白质复合物。在真核生物中，蛋白酶体位于细胞核和细胞质中，所起到的作用是降解细胞不需要的或者是受到损伤的蛋白质。泛素（Ubiquitin）是一种由76个氨基酸组成的蛋白质，广泛存在于真核生物中。在一系列酶的作用下被转移到目标蛋白上（Protein of interest, POI），介导目标蛋白的降解。

图1 泛素-蛋白酶体降解途径

图片来源：康橙投资

泛素-蛋白酶体途径作为特异性降解蛋白的重要途径，降解的蛋白包括细胞周期蛋白Cyclin、转录因子如NF-KB、肿瘤抑制因子如P53、纺锤体相关蛋白等；在应激条件下，胞内变性蛋白及异常蛋白也可通过该途径降解。泛素-蛋白酶体途径是ATP依赖的，能负责80%蛋白质的降解。2004年诺贝尔化学奖颁给了以色列科学家Aaron Ciechanover与Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose，以表彰他们发现了泛素调节的蛋白质降解途径。

图2  2004年诺贝尔化学奖得主图片来源：康橙投资；网络公开信息基于泛素-蛋白酶体途径设计的蛋白降解剂包括了蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis targeting chimera，PROTAC）和分子胶（Molecular Glues）。PROTAC作为一种双功能小分子，由目标蛋白配体和E3泛素连接酶配体通过Linker连接得到，利用泛素-蛋白酶系统识别、结合并降解疾病相关的靶蛋白。分子胶是一类可以诱导或稳定蛋白质间相互作用的小分子化合物。当其中一种蛋白质分子为泛素连接酶时，分子胶可以引起另外一个蛋白质发生泛素修饰，并通过蛋白酶体途径发生降解，与PROTAC有异曲同工之妙。

1.2 PROTACPROTAC是作为双功能分子，一端是结合目标蛋白的配体，另一端是结合E3泛素连接酶的配体，通过一段Linker连接。在体内可以将靶蛋白和E3酶拉近，使靶蛋白被打上泛素标签，然后通过泛素—蛋白酶体途径降解疾病相关的目标蛋白。

图3 PROTAC作用机理图片来源：康橙投资

自2001年PROTAC概念的首次提出到2015年首次有基于VHL和CRBN的E3连接酶配体的PROTAC分子报道，到2019年Arvinas的全球首个开展临床试验的PROTAC分子ARV-110，再到如今多个PROTAC分子进入临床的炙手可热，PROTAC技术顺利完成了从概念到临床试验的飞跃，并且在多种疾病的治疗领域表现出自己独特的潜力。值得注意的是，2021年4月7日海思科自主研发的PROTAC新药HSK29116获批临床，用于复发/难治B细胞淋巴瘤，成为国内首个获批临床的PROTAC分子。鉴于讨论PROTAC技术的相关报道较多，在本文中我们仅对PROTAC技术的优缺点进行简单分析（如表1所示），并对未来的突破方向进行展望。

图4 PROTAC技术发展的里程碑图片来源：Nat Rev Cancer (2021). DOI:.org/10.1038/s41568-021-00365-x.

表1 PROTAC与传统小分子对比

信息来源：康橙投资

迄今为止，PROTAC技术已经在尝试用于肿瘤（如AR、ER）、神经变性疾病（如Tau蛋白）或炎症/免疫学（如IRAK4、RIP2K）疾病领域，临床进展最快的化合物（ARV-110与ARV-471）也顺利进入临床二期。PROTAC技术取得的骄人进展是有目共睹的，但是目前依然面临着溶解度低、透膜性差、代谢不稳定、开发周期长与作用靶点相对有限等诸多问题，学术界与工业界都在竭诚努力实现新的突破。我们认为新的突破可能会在如下几点：

1. 寻找更为合适的E3泛素连接酶及配体，以获得具有更好成药性或（和）更佳组织靶向性的PROTAC分子；

2. 借助基于结构的药物设计（FBDD）与AI辅助的药物设计（AIDD）来加快PROTAC分子的研发速度，提高研发成功率（国内Biotech公司星亢原生物已在此布局）；

3. 对于较难获得抑制剂的靶点，可以考虑借助激动剂的识别作用设计PROTAC分子；

4. 开发更完善的生物学评价体系，尽量减少PROTAC分子在酶活性-细胞活性-PK-PD测试数据的脱节与不匹配。

1.3 分子胶

分子胶能巧妙地避开了传统抑制剂的局限性，使得一部分靶点从“无成药性”变为“有成药性”，同时分子胶相比PROTAC有更小的分子量，理论上会有更好的成药性。蛋白质与蛋白质之间的相互作用驱动了大多数生物活动，分子胶可以将通常不会相互作用的蛋白质粘在一起，为人类抵抗疾病打开了新的大门。

图5 分子胶作用机理图片来源：康橙投资早在上个世纪70和80年代，科学家已经开始使用环孢菌素A（Cyclosporin A）和FK506用于防止器官移植排斥反应，在1991年才确认这两个分子是以分子胶的机制发挥作用；1996年，Deb Hung等人发现了天然产物圆皮海绵内酯（Discodermolide），它可以稳固α和β微管蛋白单体的结合；到2000年发现大环内酯WDB002，科学家开始拓展使用FKBP12作为分子胶合成途径，为简单合成化合物诱导天然蛋白的结合开辟了新的方向；2014年，科学家在Nature杂志报道免疫调节药物沙利度胺（Thalidomide，1950s用于治疗妊娠恶心呕吐，1990s用于多发性骨髓瘤）通过分子胶机制发挥作用，研究发现这类药物通过靶向E3泛素连接酶CRL4-CRBN，从而使转录因子IKZF1和IKZF3多聚泛素化，导致IKZF1和IKZF3被蛋白酶体降解。随着对分子胶作用机制的认识逐步加深，分子胶的发现也从偶然发现逐渐过渡到理性设计，同时伴随着更多的分子胶项目被逐渐报道。

图6 分子胶技术发展的里程碑图片来源：Cell. 2021; 184(1):3-9. DOI: 10.1016/j.cell.2020.12.020.

来那度胺（Lenalidomide）作为沙利度胺的第二代改良衍生物，近年来一直排名小分子药物的销售额前三名，2020年销售额更是达到121亿美元，作为沙利度胺的第三代改良衍生物的泊马度胺（Pomalidomide）2020年销售额也达到了31亿美元，度胺类分子胶取得的巨大成功也鼓舞了更多企业投入到分子胶开发中。近期新开发的分子胶项目研究进展最快的处于临床II期，分别是百时美施贵宝（BMS）的CC-90009和CC-92480；此外，还有3款分子胶项目处在I期临床试验中，分别是来自诺华（Novartis）的DKY709、来自BMS的CC-99282以及C4 Therapeutics的CFT7455。

图7 度胺类分子胶的发展图片来源：康橙投资

表2 处于临床阶段的分子胶项目

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二

溶酶体途径2.1 溶酶体途径简介溶酶体是一种酸性细胞器，通过内吞和自噬作用从质膜或细胞质中接收物质，并将其降解循环利用。溶酶体可降解蛋白质、核酸和多糖等生物大分子，也可降解细胞自身的局部细胞质或细胞器，当细胞衰老时，其溶酶体破裂释放出水解酶，将整个细胞消化而使其死亡。通过溶酶体调节细胞内物质水平对于维持正常代谢活动具有重要意义。溶酶体降解途径包括内吞（Endocytosis）/溶酶体途径和自噬（Autophagy）途径。

图8 溶酶体降解途径图片来源：J Med Chem. 2021; 64(7):3493-3507. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c01689.

自噬作为重要的溶酶体降解途径，在这里也做一些简单的介绍。自噬是细胞在外界环境因素的影响下，利用溶酶体降解自身受损、变性大分子物质或者细胞器的自我消化过程。2016年度诺贝尔生理学与医学获奖者授予了日本科学家大隅良典（Yoshinori Ohsumi），以表彰他在细胞自噬机制方面的发现。细胞自噬方式包括三种类型：巨自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）及伴侣分子介导的自噬（Chaperone-mediated autophagy, CMA）。在巨自噬过程中，自噬体的双膜囊泡将受损或老化的蛋白质/细胞器等物质通过形成囊泡的形式传递至溶酶体进行降解。微自噬是由溶酶体通过膜内陷直接将细胞物质内吞并降解的过程。分子伴侣介导的自噬具有高度选择性，借助伴侣蛋白Hsc70特异性识别降解带有独特KFERQ五肽基序的目标蛋白，协助目标蛋白进入溶酶体降解。

图9  2016年诺贝尔生理及医学奖得主图片来源：康橙投资；网络公开信息基于内吞作用和自噬作用两种不同的途径，靶向溶酶体降解途径的技术可分为以下四种类型：溶酶体靶向嵌合体（Lysosome-Targeting Chimeras, LYTAC）、自噬靶向嵌合体（Autophagy-targeting chimera, AUTAC）、自噬小体绑定化合物（Autophagosome-tethering compounds, ATTEC）、分子伴侣介导的自噬。

2.2 溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）2020年7月，斯坦福大学Bertozzi课题组在Nature发表了题为“Lysosome-targeting chimaeras for degradation of extracellular proteins”的研究论文。该研究团队首次报道了可直接靶向胞外蛋白和膜相关蛋白进行溶酶体降解的LYTAC平台，并证实了该技术的可行性、有效性、特异性及普适性。LYTAC是一个双功能分子，由寡糖肽基团（甘露糖-6-磷酸，mannose 6-phosphate, M6P）和与目标蛋白结合的抗体或小分子组成，两者用Linker连接。阳离子非依赖性甘露糖6磷酸受体（CI-M6PR）是代表性的溶酶体靶向受体（LTRs），与PROTAC类似，LYTAC通过形成“目标蛋白-LYTAC-CI-M6PR”三元复合体会被转运到细胞内的溶酶体中进行降解。

图10 LYTAC作用机理图片来源：Nature. 2020; 584(7820):291-297. DOI: 10.1038/s41586-020-2545-9.PROTAC通过蛋白酶体降解靶蛋白主要适用于胞内蛋白，而LYTAC可以通过溶酶体靶向受体诱导蛋白质向溶酶体迁移，可以靶向细胞外蛋白和跨膜蛋白。已报道的LYTAC可以成功降解EGFR、PD-L1、CD71等靶蛋白，并在靶向并降解阿尔茨海默症相关蛋白（Tau蛋白）领域表现了巨大的潜力。LYTAC在PROTAC基础上进一步拓展了降解不可成药靶点的蛋白种类，对于科学研究和临床疾病的治疗都具有重大意义。

2.3 自噬靶向嵌合体（AUTAC）2019年12月，日本东北大学Arimoto课题组在Molecular Cell发表了题为“AUTACs: cargo-specific degraders using selective autophagy”的研究论文。该团队首次报道了AUTAC平台的设计思路，并由此设计了一系列靶向MetAP2、FKBP12、BET、TSPO等蛋白的AUTAC分子。AUTAC分子主要包含两部分：降解标签鸟嘌呤类似物（如S-鸟苷酸）和目标蛋白配体，鸟嘌呤类似物可以诱导目标蛋白的Lys63（K63）多聚泛素化标记，泛素化的底物随后被自噬受体SQSTM1/p62识别，从而招募自噬体将其降解。

图11 AUTAC作用机理图片来源：J Med Chem.2021; 64(7):3493-3507. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c01689.LYTAC技术针对的是胞外或膜上的目标蛋白，不适用于胞浆蛋白。AUTAC技术用来降解胞质蛋白来说是非常理想的，特别是对PROTAC分子具有抗药性的目标蛋白，从降解底物蛋白角度看是对PROTAC与LYTAC技术非常好的补充。AUTAC的设计原理与PROTAC是相似的，都通过泛素化发挥作用；不同的是AUTAC分子不是将目标单标连在E3连接酶亚基上触发K48多泛素化，而是触发目标蛋白K63多泛素化，K63多泛素化的目标蛋白被选择性自噬途径识别降解。目前研究表明AUTAC分子具有降解目标蛋白以及受损线粒体等细胞器的能力，AUTAC技术在发现自噬相关药物领域极具潜力。

图12 部分已报道的AUTAC分子图片来源：J Med Chem. 2021; 64(7):3493-3507. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c01689；康橙投资

2.4 自噬小体绑定化合物（ATTEC）

2019年11月，复旦大学鲁伯埙/费义艳/丁澦团队在Nature发表了题为“Allele-selective Lowering of Mutant HTT Protein by HTT-LC3 Linker Compounds”的论文。该工作创造性地提出利用自噬小体绑定化合物降解致病蛋白的概念，并实现了对致病变异亨廷顿蛋白的选择性降解，有望为亨廷顿病（Huntington’s disease，HTT dieases，HD）的临床治疗带来新曙光。

ATTEC是利用自噬降解目标蛋白的一种更直接的方法，与分子胶原理类似，但是不依赖泛素化途径，因而与LYTAC也存在差异。亨廷顿病是一种遗传性神经退行性疾病，研究表明突变的HTT蛋白（mHTT）是HD的主要病因。该团队利用小分子微阵列的方法，筛选到能够同时结合mHTT和胞浆微管相关蛋白轻链3（Microtubule-associated protein light chain 3, LC3, 一种自噬相关蛋白），但不与野生型HTT蛋白相互作用的ATTEC分子（图13中的分子5, 6, 7, 8）。ATTEC分子在结合LC3后定位至自噬泡并将mHTT蛋白包入自噬体内，形成LC3-ATTEC-mHTT三元复合物，借助溶酶体最终将mHTT蛋白降解，由此表现出很好的亨廷顿病治疗潜力。

图13 ATTEC作用机理与用于亨廷顿病的ATTEC分子图片来源：J Med Chem. 2021; 64(7):3493-3507. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c01689.ATTEC分子通过直接与自噬蛋白LC3相互作用，绕过了泛素化过程，具有很大的潜力降解不同类型的靶标，包括自噬识别的非蛋白质类生物大分子，如脂类、DNA/RNA分子、受损的细胞器等，预期可应用于如肥胖、非酒精性脂肪肝、神经退行等多种相关疾病的治疗探索。

2.5 分子伴侣介导的自噬（CMA）CMA靶向肽通常由两个不同的结构域组成：一个目标蛋白结合结构域（Protein-binding domain，PBD）和一个CMA靶向序列(CMA targeting motif，CTM)。PBD片段与目标蛋白结构，含有五肽KFERQ样基序的CMA靶向序列可以被伴侣HSC70识别并传递到溶酶体表面，形成的目标蛋白-CMA靶向肽-HSC70三元复合物与溶酶体膜上的受体蛋白LAMP2A相互作用，复合物通过溶酶体膜展开和易位后进入溶酶体被降解。

图14 CMA作用原理图片来源：J Med Chem. 2021; 64(7):3493-3507. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c01689.

三小结与展望

靶向蛋白降解是药物研发领域的一个新兴方向，特别是在不可成药靶点、耐药突变靶点等领域展现了巨大潜力，吸引各大药企和资本竞相追逐，也成为小分子药物突围的风口。已报道的蛋白降解剂主要基于泛素-蛋白酶体和溶酶体两条途径：依赖泛素-蛋白酶体的PROTAC与分子胶作为极有前景的药物开发方法，可以利用特有机制降解不可成药靶点；PROTAC与分子胶存在一定局限性，利用溶酶体降解途径则可进一步拓宽靶标的选择范围。基于不同机制的各类蛋白降解剂在各自表现巨大潜力的同时，也形成了很好的互补。尽管靶向蛋白降解技术仍存在一些问题和挑战，但是我们相信随着研究的逐步深入，蛋白降解剂在不久的将来必定能助力攻克复杂疾病。

表3 各类蛋白降解剂的对比

信息来源：康橙投资

目前国内药企开发“从0到1”first-in-class产品的能力尚薄弱，但是开发“从1到100”fast-follow/me-too产品的能力却不可小觑。从小分子药物的EGFR到单抗药物的PD-1，到ADC药物的HER-2，再到CAR-T的CD19，国内药企上演过一次又一次的“百团大战”。以PROTAC为例，药明康德（603259.SH）的PROTAC平台在2019年收入已经达到4.74亿元，皓元医药（688131.SH）已设计开发出7类特色的PROTAC工具分子库包括400多种PROTAC新药开发相关产品；此外，据不完全统计，国内宣称有PROTAC管线的公司已超过20家。

由此对于考虑立项蛋白降解项目的企业，一定要吸取“百团大战”的历史经验并参考7月CDE发布的《以临床价值为导向的抗肿瘤药物临床研发指导原则》，在立项时务必重点关注竞争格局以及产品设计的差异化，避免加入内卷大军，造成人力、财力和珍贵临床资源的浪费。主要参考文献：1. Dale, B., Cheng, M., Park, KS. et al. Advancing targeted protein degradation for cancer therapy. Nat Rev Cancer (2021). DOI:.org/10.1038/s41568-021-00365-x.2. Fischer ES, Böhm K, Lydeard JR, Yang H, Stadler MB, Cavadini S, Nagel J, Serluca F, Acker V, Lingaraju GM, Tichkule RB, Schebesta M, Forrester WC, Schirle M, Hassiepen U, Ottl J, Hild M, Beckwith RE, Harper JW, Jenkins JL, Thomä NH. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 2014; 512(7512):49-53. DOI: 10.1038/nature13527.3. Schreiber SL. The Rise of Molecular Glues. Cell. 2021; 184(1):3-9. DOI: 10.1016/j.cell.2020.12.020.4.  Pei J, Wang G, Feng L, Zhang J, Jiang T, Sun Q, Ouyang L. Targeting Lysosomal Degradation Pathways: New Strategies and Techniques for Drug Discovery. J Med Chem. 2021; 64(7):3493-3507. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c01689.5. Banik SM, Pedram K, Wisnovsky S, Ahn G, Riley NM, Bertozzi CR. Lysosome-targeting chimaeras for degradation of extracellular proteins. Nature. 2020; 584(7820):291-297. DOI: 10.1038/s41586-020-2545-9.6. Takahashi D, Moriyama J, Nakamura T, Miki E, Takahashi E, Sato A, Akaike T, Itto-Nakama K, Arimoto H. AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. Mol Cell. 2019; 76(5):797-810.e10. DOI: 10.1016/j.molcel.2019.09.009.7. Li Z, Wang C, Wang Z, Zhu C, Li J, Sha T, Ma L, Gao C, Yang Y, Sun Y, Wang J, Sun X, Lu C, Difiglia M, Mei Y, Ding C, Luo S, Dang Y, Ding Y, Fei Y, Lu B. Allele-selective lowering of mutant HTT protein by HTT-LC3 linker compounds. Nature. 2019; 575(7781):203-209. DOI: 10.1038/s41586-019-1722-1.8. Mullard A. Targeted protein degraders crowd into the clinic. Nat Rev Drug Discov. 2021; 20(4):247-250. DOI: 10.1038/d41573-021-00052-4.9.  Jan M, Sperling AS, Ebert BL. Cancer therapies based on targeted protein degradation - lessons learned with lenalidomide. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18(7):401-417. DOI:  10.1038/s41571-021-00479-z.

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作者简介

郭祖浩 博士南开大学学士，主攻分子生物学；中国科学院上海药物研究所硕博连读，主要从事抗肿瘤小分子药物研发。曾任职药明康德（603259），熟悉新药研发技术、创新靶点立项、项目推进等创新药研发流程。2020年加入康橙投资，负责创新药领域的股权投资，目前已主导完成韬略生物、诺坦药业、迪赛诺三家医药公司股权投资。

公司简介

康橙投资成立于2014年，是私募新规实施后第一批在中国证券投资基金业协会完成基金管理人登记的私募股权投资机构，管理人登记编号为P1008717。

自2016年以来，公司逐步聚焦于医疗健康领域的战略投资，成功组建了以多位医学博士为核心的投资团队并建立了首席科学家制度，创始团队成员具备平均15年以上产业或资本市场从业经验。公司致力于打造涵盖产业研究、股权投资、并购基金、上市公司战略投资的“康橙医疗健康精品投行”。公司目前已在创新药、CDMO、分子诊断核心原料、肿瘤早筛、mRNA、疫苗、高值器械、医美等领域投资了一批优质企业。