【套路是这么玩的】reviewer质疑外泌体不纯咋办?老司机带你用实验堵他的嘴!

还是熟悉的字体,还是熟悉的味道,还是那个逗逼兼老司机的hzangs!
原汁原味的hzangs又来逼逼了。既然是逼逼,那就请准许hzangs在这里瞎白活几句,看干货的。直接跳过前三段,谢谢!

第一段!近一年来,外泌体领域发展那叫一个迅猛,国自然中标量是翻倍的涨。但是我们要学习一下当年邓小平爷爷的犀利眼光!然后做出一个结论——目前处于外泌体研究的初级阶段!

犀利!

第二段!目前该领域在生物学和医学中的重要性已经逐渐显现,但外泌体研究还处于并将在一段时间内一直处于初级阶段!这个初级阶段包涵两层含义:1、外泌体领域已经逐渐被人们打开、逐渐被人们认识。2、外泌体的理论体系和研究技术还不完善,还要经过发展并逐渐从初级阶段发展成为一个成熟的研究领域。这是基于目前外泌体领域还没有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法、对其他囊泡与外泌体的区别依旧不是十分清楚而作出的判断。

hzangs就随便逼逼几句,别太当真。

第三段!Ps:这段话有没有感觉有点熟悉呢。hzangs其实本想学政治学的,阴差阳错跳了生物的坑,其实吧,政治学也是个坑(ˉ▽ ̄~) 切~~,hzangs就是一个注定开启人生hard模式的杯具啊。请大家以后根据需要称呼我hzangs或者杯具!

正文来了哈! 前面铺垫已经结束,由于目前外泌体分离方法还不是很统一,而且分离的效率和纯度都不是很高。蔗糖垫超速离心的纯度不错,但是这个实在繁琐,外泌体之家团队里的个别小朋友已经要被蔗糖垫折磨疯了,所以要求所有的实验都基于蔗糖垫超速离心是不大现实的,但是包括差速超速离心在内的其他方法都不能拿到特别纯的外泌体,那我们又该怎么样避免外泌体样品中的杂质影响我们的结果呢,这就需要利用各种严格对照及rescue(ps:这个词实在不知道怎么翻译,大概就是所谓的“回补实验”吧)来实现了。

记得在hzangs在大一的时候,实验室的一个师兄对我说,“不要把论文想象的太难,它就是新时代的八股文。”到研一之后在新的实验室又一次听到了这句话。当时比较傻,一直不明白。随着在实验室从极品小鲜肉变成回锅老油条(如下图),对这句话也逐渐有了深刻的理解。

变变变!!

所有的生物湿论文,功能实验无外乎3个部分,目标基因的过表达和敲低看功能、寻找下游重复目标基因的功能、rescue目标基因的功能! 其他的内容主要是机制研究,研究如何调控、通过什么方式调控等等,而机制实验就一个要点——设置严格的对照。完活~

下面呢,hzangs具体给大家分析一下运用哪些实验堵reviewer的嘴。

hzangs在这里用王红阳、王林辉老师发表在cancer cell 的paper举个栗子

。原文:Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA.

Reviewer扔来炸弹!No.1

reviewer问:“你怎么知道你的lncRNA是在外泌体里面,而不是你分离外泌体的时候将游离的lncRNA一起分离到了外泌体溶液中?”

这样做!

简单有力! 用RNase单独处理外泌体样品,发现与对照相比lncRNA在样品中的丰度不变;但如何将破膜剂与RNase同时使用,lncRNA在样品里的丰度明显低于了对照。这足以说明,这个lncRNA是被膜包被的,样品里有完整膜结构的只能是外泌体(Evs等 忽略这个细节)!如果是目标分子是蛋白怎么办呢?一样的,把RNase换成proteinase,把qPCR实验换成WB,拿走不谢!

成功堵嘴!

Reviewer扔来炸弹!No.2

如果reviewer又问了:“你怎么知道是你外泌体中的RNA起作用而不是外泌体样品中作为杂质的游离RNA发挥作用的?”

这样做!

拿不同来源的外泌体处理非耐药细胞,看细胞耐药能力(786-O是母细胞系、7Su3rd是从前者利用药物筛选得到的抗药细胞系,suni是一个化疗药的名称)。本来7Su3rd的外泌体是可以赋予非耐药细胞耐药能力的(图中紫色线),但是利用siRNA敲低7Su3rd中lncRNA后拿到的外泌体不再具有这一能力(图中橘黄色线)。因为前文已经证明lncRNA在囊泡里,这样就完美回答了reviewer的疑问。Ps:曾经论坛里的惜名大神还为我们提供了另一个思路,即使用RNase和proteinase处理掉外泌体样本中的杂RNA和杂蛋白,然后再拿这个外泌体实验,拿到与之前一样的结果,也可以说明起作用的分子在外泌体里面。

又成功堵嘴!

Reviewer扔来炸弹!No.3

如果reviewer再问了:“你怎么知道是你外泌体里的特定RNA传递到了受体细胞,而不是外泌体刺激受体细胞表达了特定的RNA?”

这样的问题有点丧心病狂啊! But 老司机有办法。一般reviewer也不会这么丧心病狂,所以hzangs也就不再贴文章了。毕竟让人感觉hzangs看paper很多,是一种不谦虚的表现。

假设我们研究的是RNA-a ,这种问题可以通过两种方法证明:1、直接在受体细胞中利用CRISPR-cas9敲除a基因,再利用外泌体刺激受体细胞,之后检测受体细胞中RNA-a的水平,如果在受体细胞中检测到了RNA-a,即可证明RNA-a来源于外泌体,而不是受体细胞自身表达的。2、利用点突变技术构建一个携带特定点突变的RNA-a基因,在外泌体供体细胞中过表达,然后收取外泌体,刺激受体细胞,再在受体细胞中检测发现携带特定点突变的RNA-a,而WT型的RNA-a水平没有明显变化。即可说明问题。

再次成功堵嘴!

好了,今天的和reviewer大战的姿势就交流到这里。其实hzangs的这些举例并不是十分严谨,还是需要一些其他实验来佐证自己的结果,这部分内容我们在以后的日子里在慢慢讨论。

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