关于乳腺癌HER-2 FISH判读的一点体会
要做好HER-2 FISH判读工作，需要熟悉ASCO2013版、2018版指南和中国2019版指南， 遇到明显异质性、难以直接明确判读的结果时结合免疫组化及双人计数等基本可以给出明确答案。我的个人工作体会如下，请大家指正：
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关于HER-2阳性的概念：HER-2作为曲妥珠单抗的生物标志物，是临床处方用药必须的检测指标，药物作用的靶点是HER-2蛋白分子胞外段配体结合部位，发挥受体阻断和介导免疫杀伤，所以最佳的检测靶标就是细胞膜上的HER-2蛋白分子，也就是用免疫组化方法做HER-2染色，按照免疫组化技术的敏感性特点，细胞表面1000个以下HER-2 分子常规免疫组化检测一般是阴性的，1-20万分子一般为2+，3+的话最多细胞表面可达500多万个分子（这是我曾经从一篇国外文献上看到的），所以免疫组化2+和3+ 一般有较大数量级差异，规范染色很难把2+染成3+。按实验学标准，1+以上都应该是染色阳性（大多以10%细胞着色为参考阈值），但临床上用于治疗和分子分型时HER-2 3+染色才算阳性，这就是技术上阳性和临床阈值有时存在不一致。这种不一致主要的依据时临床循证医学实验的结果， HER-2 3+的病人绝大部分可从单抗治疗中获益（与标准化疗相比）；而2+病人只有部分可以获益，对这部分病人要进一步分层，筛选出最可能获益的群体，这就是HER-2 2+要进一步做FISH扩增验证的原因。
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说一个实验：大概是15年左右（具体时间忘了），有一个比较大的临床实验（应该是回顾性实验、资料分析），证明对曲妥珠显著获益的主要是免疫组化3+、FISH 检测HER-2拷贝数/细胞≥6的人群， 免疫组化2+/FISH 阳性（比值≥2、拷贝数≥4）次之，免疫组化1+/阴性基本不获益。这个实验体现了HER-2拷贝数在用药反应/检测上的重要性，对于免疫组化3+是不需要检测的（一定要确保免疫组化染色质量），对于2+者需做FISH进一步验证，所以我们后续讨论的FISH检测问题主要是针对免疫组化2+病例。
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ASCO2013：FISH检测后，对于阴性病例（比值＜2且拷贝数＜4）、簇状阳性病例很好判读；对于典型阳性（比值≥2、拷贝数≥4）只要把握好观察视野都没有太大问题。对于出现的不典型/不确定的以下信号类型13版主要是进行描述/备注：⑴比值≥2、拷贝数/细胞＜4，可能存在单倍体等情况，为可疑阳性，临床用药效果依据不足；⑵比值＜2、拷贝数≥6，可能存在多倍体或染色体局部扩增，建议临床综合考虑；⑶比值＜2，拷贝数4-6之间，可能存在低度扩增或染色体非整倍体，发不确定。13版后几年经常会出现这些不确定FISH结果，临床也很不满。
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ASCO2018、中国2019版：2018年4月底ASCO新指南发布，刚好我有一个不确定的病例，就直接按新版发了。新版对于上述三种不肯定结果又做了进一步说明，基本给出确定性判断，对结果要进行备注说明。⑴比值≥2、拷贝数/细胞＜4，双人双盲计数结合免疫组化，如果免疫组化为2+以下判读FISH阴性，3+判为阳性（3+本不需要做FISH呀）；⑵比值＜2、拷贝数≥6， 双人双盲计数结合免疫组化（其实这部分病例阳性信号很明显），1+判为阴性，2+以上判为阳性（本来2+才做FISH呀）；⑶比值＜2，拷贝数4-6之间，双人双盲计数结合免疫组化，2+以下判为阴性，3+判为阳性（国外3+还做FISH吗?不懂）。此次更新基本解决了原来三种不确定情况的明确判断。此次更新着重强调了免疫组化在确定性判断中的作用，加强了FISH计数准确定的要求。
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中国2019版：⑴比值≥2、拷贝数/细胞＜4，较大规模实验证明这种现象基本不会出现HER-2 3+，备注后发阴性。⑵比值＜2、拷贝数≥6， 此种结果是免疫组化基本不会出现1+， 可直接判阳性。本分病例可能存在着丝粒与HER2共扩增，如果用Ral1基因代替着丝粒，就会是典型的阳性；⑶比值＜2，拷贝数4-6之间， 备注后2+以下判为阴性 。中国版与ASCO区别：ASCO强调了计数准确性（双人双盲）及参考免疫组化结果的重要性；中国版强调了增加细胞计数以降低计数的偏倚。但对于第1、3种情况，增加细胞计数影响不大，都倾向于发阴性报告；对于第2种情况增加细胞计数可能会稀释HER-2信号数，导致结果滑落到第三种情况而倾向于阴性，要注意。
06
观察计数的流程和规范：指南都是这样说：通看全片，观察异质性，也可以对照免疫组化，找到最可能扩增的区域，计数2个浸润癌区域，最少20个细胞，到底是必须计数2个浸润癌区域，还是只要计数20个细胞（有的一个区域就几百个细胞），计数两个区域的结果是平均？还是一起算（要一起算，就得2个区域挨着）？又说异质性的问题，如果FISH存在异质性，要求扩增细胞≥10%浸润癌细胞，那前面计数要求的20个细胞或多至60个细胞阳性达不到10%总瘤细胞，还算不算阳性？反正有点费脑子。
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异质性：异质性本来就是肿瘤的特征，肿瘤干细胞发育中附加了不同的突变事件形成不同表型的细胞亚群，HER-2免疫组化判读时的10%阈值本身就说明表达异质性，并不是2+的病例所有细胞都是2+。我个人认为指南说的FISH异质性更多是指基于免疫组化2+细胞亚群FISH检测出现的不均一或异质性，我觉得这个异质性没必要太纠结，是正常存在的。
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我的判读体会：一个基本思路：HER-2检测主要是检测扩增阳性病例，遇到比较不明确的结果，不能盲目的扩大细胞计数而稀释了可能的阳性结果，要把最可能受益的病人筛选出来。FISH检测前要先看免疫组化片子，特别是小穿刺组织，要保证足够的细胞量（理论上至少20个以上，通常需要60个以上浸润癌细胞2+）；判读时要先将原位癌排除（原位癌大多数情况下簇状、部分点状扩增），通看全片（有的单位为了加快速度，杂交全片只保留了免疫组化2+部分组织），初步判断整体的扩增情况，特别注意组织边缘、有个别瘤巨细胞区域不要漏检，然后找到染色良好（细胞轮廓清楚、重叠少、信号点清晰区域，这就要求组织处理、制片、杂交水平要高）且HER-2点增多最明显的区域（一般和2+区域是对应的），大体预估镜下癌巢细胞数及染色均一性，如果细胞数比较多且信号点增多比较均一，就直接计数20个细胞信号点最多的细胞，必须挨着一个一个细胞计数，计算结果，够上阳性就发；如果出现不确定的结果，我个人觉得只要计数准确，（也可以让另一人计数同一视野）不需要增加细胞计数，可以根据计算结果结合免疫发报告并备注。如果镜下显示可能扩增的细胞数少，信号点明显多的就20多个，如果增加计数可能会稀释潜在的扩增，此时先计数这20个最多的细胞，然后再继续挨着计数到60个细胞，分别计算20个、60个细胞的计数结果，如果两者总体差别不影响判读就可以按20个细胞的发，如果计数60个细胞后稀释了扩增点，则还是前20个发，同时必须再次复审免疫组化片子，看看免疫组化判读是否准确，整体着色是否倾向于阴性，如果整体片子勉强够2+（细胞数少或阳性较弱但必须包绕完整），FISH又只有20多个细胞够阳性，那么还是要慎重，可以发阳性，但必须要备注一下，建议临床综合考虑；免疫组化1+也有极少部分病例会出现FISH扩增， 遇到这种情况最好再做一次免疫组化，并根据情况给临床说明一下。对于存在的一群瘤细胞里一个或几个瘤巨细胞，这些细胞里可能会有多个至十几个点，但周围有可能是正常点细胞，对这些我觉得还是按整体逐个细胞计数的基本原则处理，这些大细胞的点一般会被稀释，而发阴性，如果这些细胞比较多，按计算结果还发阴性，可以备注以下。
总之，实际工作中遇到问题远不止这些，具体问题具体分析，对于不确定或特殊染色结果要敢于判断，FISH的判读离不开免疫组化结果的支持，毕竟FISH只是在做免疫组化2+的进一步筛选。
以上是我的一些体会，仅供大家参考。不一定正确，请指正
作者简介
靳耀锋 主管技师
西安交大第二附属医院病理科
国家卫健委临床病理质控中心常规技术组 委员
中国医学装备协会病理分会 常委
中国病理行业标准化委员会 常委
中国研究型医院学会病理技术组 委员
中国研究型医院学会分子技术学组 委员
在国内及陕西省较早开展分子病理检测，有较丰富实践经验。