小麦抗蠕孢叶枯病(spot blotch)基因Sb4

中国科学院遗传与发育生物学研究所刘志勇课题组近期发现了小麦抗蠕孢叶枯病基因Sb4，利用BSR-Seq策略开发与其紧密连锁的分子标记，成功将其定位于小麦4BL染色体上，研究结果近日在线发表于Theor Appl Genet杂志(Zhang et al., 2020)。
2015年我们在一个常规育种杂交组合“中育1211”דGY17”的F2代群体(5H8082)中选择保留了31个综合性状优异的单株，在翌年的31个F3代家系(6H2049-2110)中发现了3个呈现正常叶片和叶片枯死分离家系。其中一个包含43个单株的家系(6H2099-2100)呈现34株正常叶片 : 9株叶片枯死分离。将该家系这43个单株收获后种植成43个F4代家系，发现其中有11个为纯合正常叶片家系，23个为正常叶片与叶片枯死分离家系，9个为纯合叶片枯死家系，经卡平方检验符合单基因的遗传分离比率。从23个分离家系中选取237个单株(187正常叶片:50叶片枯死)构建遗传作图群体，并对其F5代家系进行表型鉴定，结果呈现67个纯合正常叶片家系，120个分离家系和50个纯合叶片枯死家系，卡平方检验依然符合单基因的遗传分离比率(图1，表1)。由于“中育1211”和“GY17”均为正常叶片品系，推测控制该杂交组合正常叶片遗传的为两个互补的基因，当两个基因位点均为隐性时，单株会表现出叶片枯死的性状。而F3代6H2099-2100家系为其中一个基因的遗传分离。
图1 小麦抗叶枯病基因Sb4定位群体的系谱来源
表1 小麦抗叶枯病基因Sb4遗传分析

为了确定导致叶片枯死的病原菌，按照柯赫氏法则对致病菌进行分离验证。利用叶片枯死植株的叶片和种子分离病原菌，对分离得到的病原菌进行保守ITS区扩增和序列比对，并在显微镜下观察其分生孢子形态，最终将其鉴定为平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana(图2)。

图2 小麦叶枯病原菌分离和表型鉴定

在温室中将正常叶片和叶片枯死纯系植株种植在经灭菌消毒的土壤中，将分离到的病原菌回接到土壤中，对接种后的植株进行表型观察，发现叶片枯死家系植株接种后叶片和穗部出现相应叶枯病斑，而正常叶片家系植株未出现叶枯病斑(图2)。证明平脐蠕孢菌B. sorokiniana是小麦叶片枯死分离群体的致病菌，该群体的病害类型为小麦蠕孢叶枯病(Spot blotch)。
图3 小麦抗叶枯病基因Sb4的BSR-Seq分析结果

随后分别从F4代11个纯合抗叶枯病家系和9个纯合感病家系中分别选择30个纯合抗病单株和30个纯合感病单株的叶片构建抗、感混合池，进行RNA-Seq测序，采用Bulked segregant RNA-Seq (BSR-Seq，混池转录组测序)的策略对该叶枯病分离群体中的抗叶枯病基因进行分子标记定位。BSR-Seq分析结果表明与抗叶枯病基因显著关联的单核苷酸多态位点(SNPs)主要富集于2B与4B染色体区段(图3)，利用BSR-Seq分析得到的关联SNPs开发SNP分子标记，获得了B6602、B12803、B16906、B43602、B3202、B6811和B6901等7个与抗叶枯病基因连锁的分子标记(图4)，均位于4B染色体上。而位于2B染色体上的SNP开发的分子标记均与目标基因不连锁。至于为什么BSR-Seq分析出的位于2B染色体的多个可能与抗叶枯病基因显著关联SNP均与目标基因不连锁，目前还缺乏确切的原因和解释。或许与构建混合池时所选择的对应性状个体恰巧在2B染色体区段存在较大的遗传差异有关。

图4 与小麦抗叶枯病基因Sb4连锁的多态性标记

经在237个单株的分离群体上进行分子标记分型构建遗传连锁图谱，将抗叶枯病基因定位于4BL染色体臂上，介于分子标记B6811和B6901之间7.14 cM遗传区间，命名为Sb4。进一步利用中国春4BL参考序列开发定位区间内的多态性SSR和SNP分子标记，选用SSR标记YK6819和YK15718筛选了进一步扩大的精细定位群体中3702个单株样本，获得了588个重组体，并对重组体下一代家系进行了表型鉴定。利用定位区间内的多态性分子标记对588个重组体进行基因型分析，构建了Sb4的精细遗传连锁图谱，将Sb4定位于分子标记YK12831和YK13104之间1.19 cM遗传区间，对应中国春4BL染色体1.34 Mb的物理区段，可注释出21个高可信度的基因(图5)，为Sb4图位克隆奠定了基础。

图5 小麦抗叶枯病基因Sb4遗传连锁图谱

由于小麦的异源六倍体特性，许多性状受A、B和D基因组上的两个或三个基因共同控制，非常有利于研究部分直系同源基因(Homeolog)功能、剂量效应(Dosage)、基因互补效应(Complementary gene)、多倍化(Polyploidy)和基因互作(Gene interaction)。在完全正常小麦品种间的杂交后代中，偶尔会在一些杂交组合的杂种F1代观察到杂种坏死(Necrosis)和杂种弱势(Hybrid　weakness)等现象，缘于两个基因的互补；在许多杂交组合后代分离群体和分离家系中，经常会观察到某些性状呈现出简单的符合孟德尔遗传比率的分离，可作为这些性状遗传分析和基因定位的初级群体。对其中的单株后代家系进一步进行表型鉴定，利用杂合分离家系衍生出更大的分离群体，可以对目标基因进行精细定位和基因克隆。由于这些后代材料(单株或家系)通常来源于一个杂交组合的F2单株，由此衍生出的后代分离群体往往其它性状分离较小，对所关注的目标性状来说遗传背景相对简单，有利于目标性状的表达和鉴定，是难得的遗传研究材料。
小麦蠕孢叶枯病是叶枯病的一种类型，之前发现的抗蠕孢叶枯病基因有3个，其中Sb1位于7DS染色体，与已经克隆的持久抗病基因Lr34/Yr18/Sr57/Pm38/Ltn1是同一位点，编码一种ABC transporter，具有一因多效作用(Lillemo et al. 2013)；Sb2是从小麦品种扬麦6号中发现的抗蠕孢叶枯病基因，位于5BL染色体(Kumar et al., 2015)(见小麦抗蠕孢叶枯病基因Sb2)；抗蠕孢叶枯病基因Sb4是我们实验室继发掘出位于3BS染色体的抗蠕孢叶枯病基因Sb3(Lu et al., 2016)之后发现的另一个抗蠕孢叶枯病基因，这些基因的发掘为小麦抗蠕孢叶枯病遗传机理解析和抗病育种奠定了基础。

参考文献

  1. Kumar S, Röder MS, Tripathi SB, Kumar S, Chand R, Joshi AK, Kumar U. (2015) Mendelization and fine mapping of a bread wheat spot blotch disease resistance QTL. Mol Breed. 35:1-10

  2. Lillemo M, Joshi AK, Prasad R, ChandR, Singh RP (2013) QTL for spot blotch resistance in bread wheat line Saarco-locate to the biotrophic disease resistance loci Lr34 and Lr46. Theor Appl Genet 126:711-719.

  3. Lu P, Liang Y, Li DL, Wang ZZ, Li WB, Wang GX, Wang Y, Zhou SH, Wu QH, Xie JZ, Zhang DY, Chen YX, Li MM, Zhang Y, Sun QX, Liu ZY. (2016) Fine genetic mapping of spot blotch resistance gene Sb3 in wheat (Triticum aestivum). Theor Appl Genet. 129:577-589

  4. Zhang PP, Guo GH, Wu QH, Chen YX, Xie JZ, Lu P, Li BB, Dong LL, Li MM, Wang RG, Yuan CG, Zhang HZ, Zhu KY, Li WL, Liu ZY. (2020) Identification and fine mapping of spot blotch (Bipolaris sorokiniana) resistance gene Sb4 in wheat. Theor Appl Genet.

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