更好的认知EMS相关不孕：
内异症影响卵母细胞质量和胚胎发育研究进展
Gettingto Know Endometriosis-Related Infertility Better: A Review on How EndometriosisAffects Oocyte Quality and Embryo Development
塔拉（辽宁丹东市中心医院，医学硕士，主任医师，复发性流产门诊主任。若光医学研究中心进修医生）王陆颖（中南大学湘雅三医院妇产科，医学博士，主治医师）王若光（长沙高新开发区若光医药科技有限公司，若光医学研究中心，医学博士，生物学博士后，教授、博导）王陆颖（中南大学湘雅三医院妇产科，医学博士，主治医师）
摘要：子宫内膜内异症（以下文中统称内异症或EMS）相关性不孕通常是临床看到生殖能力显著受损情况时，才被发现是由于存在子宫内膜异位症所致。相关已经描述诸多EMS的病理生理机制，且均是为了解释内异症患者出现生育力受损的深层机制。在本文这个批判性分析论证中，作者综述了EMS存在的各种损害卵母细胞和胚胎的质量的分子机制。活性氧簇，免疫系统失调和细胞结构破坏都是损害卵母细胞和胚胎有序发育的关键机制。EMS生殖细胞组织在分子水平损伤机制论证，基于分化，增殖和凋亡的细胞局部调节功能，这些环节在EMS中均呈现严重损害。因此，描绘其紊乱机制的精确分子图谱，有助于我们理解EMS不孕的复杂本质。从而使我们对EMS不孕的理解、诊断和治疗更接近于精准个体化。
关键词：子宫内膜异位症，不孕，卵，胚胎，质量
内异症导致不孕是众多医疗谜题之一。它是一种主要影响育龄期女性的以慢性炎症为特征的慢性良性疾病。内异症临床症状模糊而有规律性，及时和准确的诊断相当困难。很显然，内异症相关不孕的无症状及潜在病变特征，让临床应对变得更加复杂（按：王若光教授近年来已把子宫内膜异位症分为显性型EMS和潜隐型EMS）。潜隐特性隐藏了一种无法解释的错误风险，即不孕病因诊断失误和其后试管婴儿方法（IVF）失败尝试[1，2]。据估计，约30-50%的内异症妇女不孕[3]，同时有研究表明，约20-50%低生育妇女被诊断为内异症[4，5]。研究未确诊子宫内膜异位症的不明原因不孕，可能有潜在内异症，这样诊断可使病人获益并确定有效治疗方法成为可能，避免试管婴儿（IVF）方法过度使用的同时，并行有效管理[1]。把EMS纳入不孕检查方案，已被建议作为不孕不育诊查的最后一步——尽管对此仍引起热议。内异症生育力如何受损难题，在文献进展中已进行详尽讨论。相关研究表明已诊断内异症患者的受精率，合格胚胎数量，囊胚形成率，着床率和妊娠率均受到损害[6]。子宫内膜异位症的临床表现和分子表型包括：从内分泌激素失衡和免疫反应相关的内膜容受性受损，到配子和胚胎减少。这些临床症状和分子机制都有描述。内异症对细胞功能和生殖组织发育动力学方面影响毋庸置疑且不可避免，促使研究者观察内异症如何损害生育力，这些[7]包括粘连，慢性炎症，卵泡发育紊乱，黄体受损，抗子宫内膜抗体，精子缺陷，孕激素抵抗和子宫输卵管运动性受阻等构成了相关机制。而问题是哪些机制是内异症不孕的决定性因素，这些机制如何导致不孕及影响程度如何[6]？为了破译和揭示真正的致病因素，或内异症相关不孕症最关键因素，Simon等做了一个里程碑的研究，内异症病人接受供卵者的卵母细胞，其植入率和妊娠率与没有内异症的供卵者类似。随后其进一步研究观察发现，接受内异症患者的卵母细胞会导致降低着床率，这表明内异症对卵子和胚胎质量的不利于影响比对子宫内膜容受性影响更重要[8]。此外，尽管存在实质的异质性和临床观察结果的差异，一个强大的内异症分期及其对胚胎质量影响的联系已经被提出[9]。在常见疑点中，卵母细胞质量下降及其后胚胎质量受损，被认为是内异症不孕值得研究的重要参数[10]。由于卵母细胞和胚胎质量是IVF成功的两大支柱，卵母细胞和胚胎严重受损的辅助生殖患者，子宫内膜异位症导致的质量因素可能注定IVF失败。鉴于缺乏彻底的病理生理学基础分子机制的定位，对于子宫内膜异位症相关的不孕症，我们的理解是有限的。这个事实促使多米诺骨牌效应，揭示了内异症不孕诊断，治疗和管理方面的弱点和局限性。内异症及不孕不育，关注更多关于受累卵母细胞和胚胎受损分子机制信息，可作为该问题更加个体化的一项预测因子和评价手段。在目前文献回顾中，我们重点介绍所涉及分子通路，在卵子和胚胎的分子前沿角度洞悉EMS可能激活慢性炎症机制，从而损害卵母细胞受精能力及其后胚胎发育能力。这在决策中具有重要价值，强调有前途理论，并相应优先考虑它们，这些数据是确定未来方向所必须的研究。截至2020年12月，在PubMed / Medline，Embase和Cochrane Central数据库中对文献进行了全面回顾。搜索策略采用的关键词和组合关键词为：“子宫内膜异位症”，“子宫腺肌瘤”，“卵巢子宫内膜异位囊肿”，“子宫内膜异位症相关的不孕症”，“子宫内膜异位症病理生理学”，“子宫内膜异位症病理学”，“胚胎质量”，“胚胎发育停滞”，“卵母细胞质量”，“卵母细胞成熟”，“腹腔镜检查”，“体外受精”，“辅助生殖”，“辅助生殖技术”，“医疗辅助生殖”。该搜索仅限于在同行评审期刊中以英文发表的全文。原创性研究在人类和动物模型中的实验论文，也包括影响卵母细胞质量和胚胎发育质量的内异症综述。经过文献回顾分析，作者确定了子宫内膜异位症损害卵母细胞质量和胚胎发育潜力的三个主要方面，即增加活性氧簇（ROS）和自由基的产生。免疫系统失调；受损的细胞外基质重塑和减数分裂纺锤体分布。对这三个方面进行了批判性分析，突出了子宫内膜异位症影响卵母细胞质量和胚胎发育动态的主要病理生理机制。胚胎发育的一个关键的生理过程是分子氧代谢伴随ROS产生。ROS是有氧呼吸副产物和细胞代谢过程的自然组分。配子，胚胎及其周围环境可能是构成ROS释放潜在来源。内源性和外源性ROS生成因子的分类有助于更好地理解这一事件所涉及的生理过程。内源性来源包括多种代谢途径和细胞水平上的酶促激活，几种实质性的氧化酶如OXPHOS（线粒体氧化磷酸化），黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）和NAPDH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）在卵母细胞和胚胎发育中的作用更为突出。诱导ROS产生的外源性因素包括发育中胚胎周围的氧浓度，金属阳离子（metallic cations），可见光和胺氧化酶（amine oxidase），以及精子产生的ROS，它会对胚胎产生同样有害的影响[11]。这些正常的氧化代谢过程将在细胞中产生ROS；因此对ROS产生这种危险事件，机体有一种安全机制来对抗——这就是抗氧化剂的产生。自由基和抗氧化剂之间失衡会导致有害的氧化应激[12]。当抗氧化机制不能平衡ROS的生成，氧化应激就发生了，这是哺乳动物中产生自由基的最重要类型。氧化应激不仅仅可能是内异症发病机理的一部分，也是疾病进展的一部分，成为导致局部组织受损和细胞功能障碍的原因[13]。尽管如此，人们不应该不强调ROS的有益作用，正如之前提到的，它是生理过程的必须成分。他们参与介导了健康组织正常发育、分化和凋亡信号传导。他们对生殖系统的调节作用包括卵泡的发生，卵母细胞的成熟和黄体的溶解，植入过程和胚胎发育调节[14，15]。虽然ROS过度表达是有害的，氧化应激水平失活也可能导致细胞发育受损和失调[16]。内异症和ROS的关联在文献中已经有透彻研究[12]，EMS病变引起的ROS生成增加可归因于EMS细胞的高增殖率[13]。为了阐述EMS不孕ROS的作用，应指出的是ROS和抗氧化剂之间的失衡，促进了腹膜，卵泡液和卵巢的氧化应激因子聚集[17]。正如所描述的，EMS细胞表现为ROS产生升高的表型改变，除与不孕症相关外，还被认为是导致EMS播散的促进因素[13]。因而，EMS患者氧化应激生物标志物明显增加[12]，ROS还构成促炎介质调节和慢性炎症条件的重要组分。综上所述，我们得出结论：内异症病变引起ROS产生改变，可能通过直接失调细胞过程或间接通过炎症机制，对输卵管微环境，生长发育的卵泡，以及卵母细胞和胚胎质量造成不利影响。关于经血逆流入腹膜腔理论的另一个值得讨论的方面，就是回流月经血中存在大量破碎红细胞，而导致铁水平升高，这是导致体内自由基产生的来源之一[18，19]。由于其高度不稳定和活性状态，当大量存在时，则会破坏细胞器和细胞关键分子成分[6]。更重要的是，强烈的血红蛋白破坏和高负荷铁介导产生羟基自由基（hydroxyl radicals），这是最有活性的自由基簇，影响氨基酸，嘌呤和嘧啶，也包括细胞膜磷脂，引发了脂质过氧化的多米诺效应[20]。丙二醛（MDA）作为脂质过氧化反应的指标，也是氧化应激的标志。研究表明，与非EMS相比，EMS患者卵泡液中可以检测到MDA水平上升[19]。此外，数据表明，在EMS患者中细胞抗氧化机制明显受损。研究表明，谷胱氨酸S转移酶（GST）浓度和功能均受损，这突出表明其总抗氧化能力减弱[21，22]。ROS的过度产生也影响了细胞中分子成分，即三磷酸腺苷的合成(ATP)或者细胞内钙离子浓度。这反过来会引发一系列干扰大量细胞功能的事件[23]。最初，线粒体DNA损伤引起ATP耗损，导致鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate, GTP）产量下降，微管相关蛋白（microtubulin -associated proteins, MAPs）磷酸化水平降低，而MAPs对于组装微管和维持所需的动态不稳定性至关重要[24，25]。此外，作为氧化应激生物标记物，还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化谷胱甘肽(GSSG)比率受到影响，从而参与聚合-解聚过程中，而升高的钙离子水平抑制聚合并增强微管的解聚[23，24]。此外，ROS能够直接灭活参与MAPs激活的酶，这些MAPs维持微管和目标DNA诱导染色体畸变的动态平衡，正如在仓鼠模型上记录的那样[26]。ROS对生殖生理产生了多方面的不利影响，即卵母细胞成熟，卵巢类固醇激素合成，排卵，植入和胚泡形成。ROS的细胞毒性效应包括磷脂过氧化，脂质过氧化会导致了细胞膜通透性增加，细胞膜完整性受损，ROS的细胞毒性还有酶激活和伴随酶功能失调，DNA结构损害和随后的细胞死亡[27，28]。关于ROS对卵母细胞影响，在小鼠实验中显示减数分裂过程中纺锤体微管的解散，归咎于微管二聚体（即微管亚单位）失调对微管动态平衡的破坏。正如衰老自由基理论显示的那样，对微管动态不稳定和他们运动动力的影响，导致减数分裂过程中染色体错误分离[23，29]。这种非稳态的染色体错误分离导致非整倍体，生殖力受损。氧自由基认为是对胚胎发育和成长是负相关[28]。有趣的是，在小鼠胚胎中有研究，在培养基中加入抗氧化系统的关键成分即超氧化物歧化酶时，由ROS引起胚胎停育能够逆转[30]。由于ROS通过细胞膜扩散并且和细胞分子相互作用[11]，ROS产生引起的胚胎受损和伴随细胞大量功能受损程度是无法预测的。胚胎毒性和致畸已有更进一步研究描术[31]，这些丰富了由氧化应激导致的阻碍胚胎发育质量的系列因素。ROS损伤也是由脂质过氧化引起的，脂质过氧化是组成质膜的多不饱和脂肪酸的氧化破坏[32]，这种现象增加了细胞膜通透性，降解了膜完整性，酶破坏和失活，以及DNA结构损伤。在这些情况下，细胞死亡则不可避免[33]。由于ROS诱导脂质过氧化，细胞分裂，代谢物传递和线粒体功能都也受到损害。再者，ROS对蛋白的作用也是有害的，促进细胞周期失调，细胞核中DNA碎片化，而引发了胚胎停育发生[34]。线粒体DNA进一步受到细胞内ROS影响，因为他对突变易感。代谢功能障碍能够促进胚胎停育，偶尔代谢改变也会引起凋亡。内异症伴随着ROS高水平。因此，关于这些代谢副产物导致生育力下降甚至不育的生理过程复杂化的程度，提出了一些思考。有趣的是，ROS对牛胚胎植入动力学的影响取决于暴露于ROS的胚胎所处的发育阶段。受精卵和囊胚被认为是特别敏感的，不能抵抗外源性H202的毒性效应[35]。保护胚胎发育不受ROS影响的体内的防御机制，包括抗氧化剂，修复机制和在ROS形成初始阶段破坏分子通路破坏等[36]。基于这些观察，提出了内异症患者最佳胚胎培育时间的问题。一方面，在体外培养所提供控制条件下，尽管胚胎自身代谢活动产生ROS活性有限[14]，胚胎没有体内腹腔液中情况那样，暴露于ROS环境。另一方面，这些安全的培养条件和没有ROS作用，胚胎没有启动任何防御机制，也没有显示出任何对抗ROS修复机制。受EMS影响的胚胎是否应该更早的转移到子宫中以更好的适应？这是否有助于修复潜力和进一步确定与子宫内膜有价值的联系，哪个是成功植入的先决条件？或者保留在低ROS环境中及减轻表观遗传学改变，这是否是最好的方法？氧化应激标志物如铁，NO的检测，可作为无创性诊断工具[37]，因此，研究者应优先考虑对其识别[38]。此外，抗氧化剂在EMS防治中的益处需要更深入探索[37]，同时需要临床试验来确定他们的有效性[17]。整体来讲，氧化应激如何在内异症相关性不孕中起作用，这项研究仍然需要透彻的研究，并反馈给医生。然而，在众多细胞功能中积累的修饰无疑与强烈的凋亡事件有关，这有助于形成一个充分的解释，作为未来研究和结论的基础。在下面的表1和图1分别概述了ROS产生机制，及其对卵母细胞和胚胎质量的不利影响。
表1：总结了EMS患者ROS产生机制，以及ROS诱导的卵母细胞和胚胎损害
图1：ROS和自由基对卵母细胞质量和胚胎发育能力的影响。
EMS病灶组织特点是高度增殖，抗氧化应激酶受损。结果，在内异症病灶中ROS产生和分泌是明显增加的。而且，经血逆流有红细胞破裂，从而释放出大量的铁分子。铁水平是体内自由基产生的来源，导致ROS和自由基进一步增加。ROS和自由基增加导致促炎因子释放，从而发生慢性炎症。ROS对卵母细胞和胚胎有直接损害。许多分子和细胞过程遭到破坏，导致卵母细胞和胚胎发育受损。因此，在EMS患者中常见胚胎停育和植入下降。此外，大量ROS产生和免疫系统失调对女性生殖系统功能有不利影响。排卵过程和卵巢类固醇合成都发生明显失调。输卵管，卵巢和子宫微环境明显损伤，导致内膜容受性受损。
ROS：活性氧簇；ATP：三磷酸腺苷；DNA：脱氧核苷酸；MAP：微管相关蛋白。
免疫系统的复杂性要求它的机制是维持稳态，当机体受到破坏时恢复生理过程的平衡。子宫内膜异位症时，在异位区域发现子宫内膜细胞存在，这里免疫系统缺陷无法检测和消除异位细胞，从而允许他们错误的植入和生长[39]。总之，EMS能够促进异位的内膜细胞改变免疫耐受。由于这些细胞保留了对激素的反应能力，能够周期性激活，因此他们能诱发炎性反应最终进入慢性炎症[7]。在最初的急性炎症相能观察到辅助性T细胞和调节性T细胞的涌入。在慢性炎症期，招募来的巨噬细胞能够依次激活粘连和血管形成。从已公布的数据中可以证明，细胞因子，趋化因子和前列腺素等这些关键的炎症介质，在内异症病人腹腔液中其水平是升高的[40]。除了ROS的重要作用外，由于EMS促进了炎症因子和信号分子聚集，腹腔液中的细胞因子进一步会干扰生殖功能[41]。更为重要的是，尽管ROS是信号通路的第二信使，他们也可能作为产生细胞因子的基因表达调节因子，以及产生大量免疫反应的调节因子[42]。反之亦然，EMS的持续炎症状态激起持续的免疫激活，导致ROS增强和大量生成，伴随着内膜细胞表达大量抗原产生。腹腔液中包含有参与免疫反应的细胞，配子和胚胎都暴露其中[41]。正常情况下，腹腔液中主要是正常范围内的巨噬细胞，淋巴细胞，嗜酸粒细胞和肥大细胞。EMS细胞促进炎症，因而激活巨噬细胞[43]。内异症病人腹腔中的巨噬细胞被激活了，分泌出细胞因子。至于为什么在内异症患者腹腔液中巨噬细胞如此激烈激活，由Halme提出在内异症腹腔液中巨噬细胞衍生生长因子增多，导致巨噬细胞成熟化[44]，巨噬细胞激活在轻度内异症患者中更明显[45]，这提示该疾病更需要免疫方面研究。一个主要的免疫应答调节子是IL-1，能够诱导前列腺素产生。在受精过程和胚胎早期卵裂这个时段，巨噬细胞有分泌IL-1的潜力，这会给生殖系统带来有害影响[45]。有趣的是，内异症症状越重，IL-1的活性越高，而在正常的生育女性中是监测不到IL-1。更重要的是，IL-1与成纤维细胞的增殖，胶原沉积和纤维蛋白原形成有关，于是晚期子宫内膜异位症会有纤维化和粘连出现[45]。为了总结IL-1的作用和突出它可能干扰生殖能力的途径，应该强调如下几点：它能刺激T细胞产生IL-2，而反过来IL-2也能刺激各种类型T细胞克隆扩张，它也能增强NK细胞活性[46]。而且IL-1刺激B细胞增殖和抗体产生[47]。EMS也能检测到TNF-a，IL-8，IL-10水平升高。这些分子被认为是腹腔液中巨噬细胞及其产生的细胞因子混合物[48]。VEGF水平与卵泡健康和血管化有关[49]，因此，在内异症中VEGF水平低下可能与胚胎质量受损有关[50]。在理解免疫系统损伤而引起不孕方面，这些提到的所有损伤机制则增加了其复杂性。对免疫系统的研究从另一角度揭示了EMS相关性不孕的机制。EMS患者明显的慢性炎症在多个方面影响生育力。卵泡液中有许多细胞因子如IL-1β，IL-8，IL-10和TNF-α水平升高，这可能与卵巢功能受损相关[51]。前列腺素和细胞因子能够损害胚胎发育和植入[52]，而HPO轴功能失调，后续在调节卵泡发育和卵母细胞成熟协调过程紊乱，会损害生育力[53]。在配子形成初始到卵母细胞迁移到子宫都有损伤发生，这归咎为激活的巨噬细胞诱导的细胞因子产生。由髓过氧化物酶（一种促炎前的酶）产生的氧化因子诱导，巨噬细胞激活对小鼠分裂中II期卵母细胞有害，且颗粒细胞不能提供保护[54]。内异症患者中卵母和胚胎质量受损一个理论是女性生殖系统中炎症反应存在。卵泡内IL-8，IL-12和肾上腺髓质素水平上升，而且卵泡和胚胎生殖力下降时这也是关键的预测因子[55]。IL-12和卵泡生成，卵母细胞质量和植入之间是负相关，TNF-α升高与质量差的卵母细胞和胚胎之间是有关的[56-59]。内异症中颗粒细胞周期改变应该也是细胞因子改变所致[60]。由于p27下调，IL-10水平上升会导致G0期停滞[61]，同时加上细胞因子组合IL-6，IL-1β，IL-8和IL-1α关键细胞周期相关因子的异常和紊乱[62]。另一方面，EMS可能进一步导致热休克蛋白调节失调，热休克蛋白能够保护细胞避免氧化应激和炎症。它们作为分子伴侣作用是帮助新合成的蛋白质折叠。有趣的是，抗原合成，提呈和肽结合与免疫系统是由直接相关。因此，内异症中免疫反应受到影响，热休克蛋白表达的异常升高启动了凋亡机制[63]。在EMS重度期别中，细胞凋亡增强，内异症患者的卵母细胞质量降低。参与免疫反应的分子机制会干扰排卵过程，这会促进类固醇分泌失调或黄体功能不足[39]。这种功能障碍是由于在颗粒-黄体细胞中芳香化酶活性的降低，以及孕酮产生降低和类固醇激素生成受损。在这种情况下，黄体的形成和功能受到损害，这让生育力降低变得不可避免[64]。当小鼠胚胎在EMS患者腹腔液中培养时，其生长率降低，同时DNA破碎和细胞凋亡率升高，然后发生胚胎停育[65，66]。这种累积的集体证据可以作为支持以下观点的论据：EMS患者腹腔液会对胚胎产生毒性作用，由于炎症引起尤其是TNF-a引起的胚胎毒性[67]。为了进一步强调内异症的有害影响，腹腔液中的免疫细胞经历了“氧爆炸”过程，这个过程中超氧化物阴离子和过氧化氢大量释放，组织破坏，粘连形成[68]。很明显，炎症的恶性反应释放ROS的恶性级联，ROS促进细胞因子释放，这反过来调节炎症，显示这些机制非常复杂并相互交织，也是内异症不孕病因分析和合理应对的关键。不少研究显示从EMS患者分离腹腔液，把小鼠胚胎在里面培养，得出了相矛盾的数据。一部分报道胚胎发育受损，另一部分报道没有有害影响。这两种矛盾的观点需要更深的研究。然而，遵循EMS患者植入前胚胎暴露在由腹腔液造成的有毒环境论点，应该是有价值的。思考包括3大依据：（1）即颗粒细胞凋亡是评估卵母细胞质量的工具，与正常生育女性对比，EMS患者颗粒细胞凋亡率是最高的[60]。（2）考虑到细胞凋亡的关键因素是细胞因子，细胞因子对卵母细胞和胚胎质量的影响需要更多研究才能得到相对明确的结论。（3）免疫系统紊乱的机制，以及卵母细胞和胚胎质量的损害机制，这在表2和图2中分别有总结。
表2：EMS患者中参与免疫系统紊乱的机制和随后带来的卵母细胞和胚胎损害机制总结
ROS：活性氧簇；IL:白细胞介素；TNF-α：肿瘤坏死因子α；HPO轴：下丘脑垂体卵巢轴；DNA：脱氧核糖核苷酸。
图2：免疫系统紊乱对卵母细胞和胚胎发育质量的影响。
异位的内膜病灶局部可以观察到免疫系统的紊乱。结果在异位内膜细胞中能够观察到周期性增殖和激活。高增殖水平会导致来自内异症病灶的ROS产生升高。增高的ROS和氧自由基会刺激促炎性反应，最后导致慢性炎症反应。EMS细胞促进炎症，因此腹腔液中有巨噬细胞的慢性激活。有活性的巨噬细胞分泌出大量的细胞因子和前列腺素。一方面，分泌的细胞因子导致淋巴细胞和NK细胞的激活和增殖。这些激活的免疫细胞直接影响胚胎发育，导致胚胎毒性和胚胎停育。受影响的胚胎显示出植入能力明显降低。另一方面，细胞因子和前列腺素会直接影响卵母细胞和胚胎，损害卵母细胞质量和成熟。结果是炎症导致减数分裂紊乱，导致母细胞周期停止。另外，细胞因子直接影响HPO轴调节，也影响卵巢和内膜功能，分别影响排卵过程和内膜容受性。
ROS：活性氧簇。IL:白细胞介素；TNF-α：肿瘤坏死因子α。HPO轴：下丘脑垂体卵巢轴。
在探索确定子宫内膜异位症相关不孕症元凶的多种途径中，，有人指出改变减数分裂中纺锤体的改变增加了非整倍体发生率。细胞核和胞质的损伤，即胞质碎片和凹裂是EMS的细胞学表现。更为重要的是，细胞核和胞质的成熟是成功受精的基础。任何对这些过程的干扰都会引起这些形态学和遗传性异常。这种卵泡质量的异常伴随着受精和植入率的下降[69]。卵母细胞明显的DNA损伤会导致高频率的单倍体出现，同时在腹腔液中暴露的时间与损害的程度相关[70]。5、2 减数分裂纺锤体受损及其对卵母细胞及胚胎质量影响纺锤体是减数分裂中确保遗传物质正确分离的基本组分，并维持了染色体组织。纺锤体的完整性也被认为是卵母细胞质量和动态活力的潜在标记[71]。卵母细胞的纺锤体细胞复合物容易出现微管紊乱和减数分裂错误，这支持EMS中非整倍体率增加的理论[72]。当在EMS患者腹腔液中培养小鼠卵母细胞，可以观察到微管和染色体的严重破坏，这归因于减数分裂纺锤体的改变[71]，也是腹腔液有害因素所在。对这些因素的研究表明，减数分裂纺锤体受到细胞因子水平和氧化应激水平的增加而影响，这些构成EMS的显著特征[73]。动物模型试验表明，针对减数分裂纺锤体的因素包括外源性暴露于过氧化氢和TNF-α[74]，当暴露于重组小鼠IL-6时，可以观察到小鼠卵母细胞MII期微管和染色体排列中断[75]。染色体的组成，以及第二极体形成都取决于减数分裂的纺锤体[76]。减数分裂纺锤体受损促进了染色体分散和胚胎发育停滞[77]。卵母细胞中发生减数分裂异常，导致无法正常受精，或者受精后胚胎无法正常发育[78]。此外，第一极体可能更频繁的出现异常迹象。EMS患者中这些异常包括极体释放延迟和分裂受损[79]。在动物模型中，观察到的潜在异常包括自发的卵母细胞激活，伪原核形成和被新形成的核包膜包围的核小体[80]。非整倍体发生率仍是矛盾点，因为也有相反的证据，表明在EMS和非EMS组，非整倍体率是相似或增加的[72，81]。基质金属蛋白酶（MMPs）是一个与细胞结构相关的蛋白家族，即细胞外基质（ECM）和基底膜成分的降解[82]。细胞外基质参与了关键的生理事件，如细胞增殖和分化。因此，任何改变ECM的因素都能够对正常和病理事件产生有害影响。特别的是，在广泛的EMC重塑中，如胚胎发生，MMPs作为基质降解剂是非常关键的。在正常卵泡和胚胎发育中，MMPs重塑EMC是一个先决条件[82]。MMPs的一种有效调节剂是细胞因子，如预料的，检测到在EMS患者腹腔液中MMPs水平升高，抑制物水平下降[83]。MMPs控制的蛋白水解是由金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)所调节，这两者精密调控这ECM的重塑[84]。除了卵泡和胚胎发育，排卵，黄体形成都需要大规模重塑过程。正如研究所显示，卵泡形成的精妙过程中，主要是MMP系统改造卵巢ECM[85]。在模拟EMS发生的动物模型中，由内异症病灶直接分泌到腹腔液中的TIMP1可以到达排卵前卵泡。这将导致MMP活性的改变，扰乱排卵过程和整体卵巢功能[80]。排卵后，卵母细胞复合物暴露在富含异常TIMP浓度的卵泡液中。这种大量的TIMP对卵母细胞产生有害影响，因为在整个胚胎植入前阶段，它能够渗透到细胞核中，破坏整个细胞周期，阻碍卵母细胞发育[80，86]。将内异症和不孕关联起来这个难点扩展到细胞动力学的难题（或：如果想解决内异症和不孕的难题，需要解决细胞动力学方面的难题）。可以观察到在EMS患者中有微管和染色体改变，这增加了不孕症机制研究复杂性。在小牛和小鼠卵母细胞研究中，有证据表明EMS会发生染色体和纺锤体的出错，正如Mate评论的那样，对人类的生理过程推断需要更多详实数据。最近研究显示，得出非整倍体增加这一确凿结论时仍有挑战。另一方面，有研究认为非整倍体发生和EMS不一定关联，并给出更可靠数据[6]。值得注意的是，研究EMS中非整倍体发生率及其各自的机制，在默认情况下受到限制。研究非整倍体发生率本身具有着不可避免的局限性：即炎症环境伴有大量细胞因子涌入，这种细胞因子无法被正常分泌所定义，也无法排除在EMS复杂病理生理之外。减数分裂纺锤体损害的机制，细胞外基质重塑，导致卵母细胞和胚胎受损的机制在图3和表3中分别有阐述。
图3：卵母细胞纺锤体损害和细胞外基质重塑的机制。在异位内膜局部可以观察到免疫系统失调。因此可以观察到异位内膜处有周期性增殖和激活。异位内膜局部增殖水平高导致产物和ROS和自由基产生增加。ROS和自由基产物的增加导致促炎水平升高，结果慢性炎症形成。ROS和慢性炎症都直接影响卵母细胞的分子和细胞功能。受损的胞核和胞质导致减数分裂纺锤体的无序化，进而会导致异常的减数分裂，染色体分离受损和卵母细胞发育停滞。这些损害了卵母细胞和胚胎质量，导致受精失败，降低胚胎植入效率。有研究表明EMS病人卵母细胞减数分裂纺锤体破坏能够增加非整倍体率，但是这还未达成共识。慢性炎症影响细胞外基质的重塑，影响MMPs和TIMPs生成和功能。结果TIMPs分泌增加。TIMPs能够直接进入卵母细胞胞核中，破坏卵母细胞周期。因此，TIMPs损害了卵母细胞，导致发育停止，受精失败和胚胎发育受损。
ROS：活性氧簇；MMPs:基质金属蛋白酶；TIMPs:金属蛋白酶的组织抑制剂。
表3：内异症中减数分裂纺锤体损害的和细胞外机制重塑的机制导致卵母细胞和胚胎质量损伤总结
ROS：活性氧簇；MMPs:金属基质蛋白酶；TIMPs：金属蛋白酶的组织抑制剂。
ASRM实践委员会在2012年提出：“EMS和不孕症之间因果关系尚未明确确立”[87]。在EMS发生前、中和后，对其分子机制尚未能准确描述，显示出该病诊断和管理的复杂性。很明显，发生在EMS诱导的有害的微环境中，会发生一些极端病理生理事件，这损害了分子平衡的整体状态，这是一个恶性循环。当发生EMS时，生育力下降是有相关性但是不明确。很多文献都有批判性分析，作者描述EMS如何潜在损害卵母细胞和胚胎动力学机制。总之，文献表明EMS不孕症主要原因是成熟卵母细胞数量有限[9]，伴随着雌激素合成和孕激素抵抗的激素失衡状态[88]。但是，回顾文献后无疑表明，在EMS相关不孕中，应思考卵母细胞和胚胎所暴露的受损生理事件。利用延时技术，研究人员能够检测到EMS患者改变的胚胎形态学改变和胚胎质量下降[89]。为了解疾病进展的影响和内异症相关不孕潜在的病理生理机制，许多研究都集中探索了腹腔液合成和影响。活性氧簇对细胞功能产生有害影响，因为他们有可能损害蛋白活性和基因表达失调[90]，氧化应激在EMS中作用是它可能引起了内异症发生已被彻底研究。氧化应激是炎性反应的一个组成部分[36]，进而干扰减数分裂纺锤体结构紊乱[74]和卵母细胞退化[32]。在低温保存对小鼠卵母细胞影响的实验中可以观察到，细胞骨架功能改变和减数分裂纺锤体结构紊乱，都可以降低受精率和损害胚胎发育[77]。炎症环境和释放出的细胞因子能够促进生理恶化，从而导致EMS和不孕症。所谓“燃尽效应”是由于环境毒性对卵巢储备造成的，归因于EMS引起的炎症状态对卵巢储备消耗作用[91]，这对EMS相关性不孕是非常重要的因素。这导致纤维化，血管化缺陷，皮质特异性基质消失从而导致卵泡成熟受损和闭锁加剧[91]。EMS相关性不孕，表观遗传学可能发挥了重要作用，这使EMS发病机制进一步复杂化。在手术诱导的EMS动物模型中，发现卵母细胞和胚胎质量可能受损，这个有趣的结论进一步扩展了现有对EMS的认识，结果表明，第一代未接受手术干预的大鼠的卵母细胞和胚胎，显示出卵母细胞和植入前胚胎的异常，这与EMS的母代很类似。而且第一代生育力下降。这是文献中第一次报道母亲EMS对卵母细胞和胚胎质产生负面影响，以及对后代一代代的发育能力影响。因此，由EMS引起后代永久的表观遗传学改变，这是非常令人担忧的论证，亟待在人类中进一步深入探讨[80]一些Meta分析指出EMS患者受精和植入率下降[9]，Barbosa所做的Meta分析指出卵母细胞数目减少[92]。其他研究指出，EMS的严重性与不孕状态没有直接关系。据报道，微小/轻度内异症与中度/严重内异症对比，EMS前者有更少的成熟卵泡和更低的妊娠率[93]。显而易见，EMS病人有着高度异质性[9]，这能解释我们观察到的复杂临床症状。总体而言，只有很少的研究从临床胚胎学角度探索了EMS的问题，缺乏必要的数据[9]。评估临床胚胎学数据有限，研究结果相互矛盾，无法更多推论。招募异质性患者群体，研究这种疾病的多个阶段，但缺乏对照或者严格纳入标准似乎导致了这些不一致的结论。更为重要的是，在研究药物治疗还是手术治疗时有一个差异性处理方案。评估IVF的结局是基于各种参数，缺乏异质性[62]，事实上所谓成功结论无论是成功妊娠或者活产，都无法进行比较或得出有力结论。当EMS研究在设计和实施上如此严重的局限性和差异时，我们能够依靠这些研究提供的结论来塑造和定义其特征吗？EMS许多方面都应该被认识，相反，我们错误地努力把所有的特征适合于一个严格定义的病理。或许，依赖于可能的独特的分子机制，是时候解释其临床观察的异质性了。为了说明目前文献中的限制性，损害卵母细胞和胚胎质量机制的数据都来自于动物实验。这对于EMS的研究有很大局限性。研究者强调了人类遗传物质研究的生物伦理学窘境，也提出处理人类胚胎时的伦理学限制[67]。因此，为达到研究目的，动物模型是做非侵入性诊断研究的必要工具[94]。从动物模型推断EMS对人类影响应该谨慎[79]。使用动物模型有一定局限性，因为动物对EMS症状没有异常，免疫，环境易感性[79]。更为重要的是，动物模型中超排卵现象已证实会损害卵母细胞和胚胎质量，这是一个共同的过程。因此，EMS对人类卵母细胞和胚胎的真正影响还没有得出结论。由于缺乏具体数据，EMS的最佳治疗方案仍然引起激烈争论。在多方面的病理学研究中只是观察一个参数看来是非常局限的。EMS患者中子宫内膜的分子通路是一个很有前途的研究领域。权衡子宫内膜的作用，或者卵母细胞和胚胎质量，当在这些患者疾病程度相同时，可能结论是徒劳的。理论上，需要的是一种全面的对这个复杂问题有多方面的讨论，但并不可行。尽管如此，正确的研究方法需要一次检测一个参数，这是主要难题，因为不可能用一个孤立的逻辑方法上健全的方式来研究一个参数。从诊断到治疗的一系列事件中，在EMS研究中缺乏强有力的微创工具，无法及时和精确诊断，从而达到最佳治疗策略。诊断后，因为最佳治疗方法尚未确定，临床医生处理内异症引起的不孕面临着两难境地。有效的措施包括让患者接受IVF受精或继续手术治疗EMS。通过手术干预恢复盆腔解剖和切除内异症病灶，患者可以开始辅助生殖治疗。当没有发现潜在的病理病因时，让患者开始自然受孕。正如Taylor恰当指出的那样，微小转移和所有全身效应，可能不能仅仅通过去除病灶来根除[95]。手术治疗去除了可见的内异症病灶，恢复了解剖结构，但是这足以恢复生育力吗？而且，手术切除内异症病灶是否存在损害卵巢功能风险[96]？另一方面，直接做IVF的患者有过度使用IVF的风险，并存在心理和费用支出影响。显然，在体外受精之前是否治疗卵巢子宫内膜异位症还有待进一步研究[97]。
遗憾的是，在子宫内膜异位症相关不孕症中，尚无发表过关于不同管理策略提高卵母细胞和胚胎质量的有效性的研究报道。只有在研究EMS相关的不孕症患者体外受精结果，不同治疗策略对卵母细胞和胚胎质量的影响时也只能得出间接的结论。为了更好治疗EMS相关的不孕，患者为了提高试管婴儿（IVF）结果，治疗策略也存在异质性。根据欧洲人类生殖和胚胎学会（ESHRE）的指导方针，根据欧洲的循证医学，在微/轻EMS患者中通过腹腔镜手术切除内异症病灶能够增强IVF成功率[98]。关于严重的深部浸润性EMS，在IVF前ESHRE专家不建议手术切除内异症病灶，因为没有强有力的证据显示这个方法有益[98]。关于巧克力囊肿，ESHRE强烈推荐临床医生在IVF之前当巧克力囊肿大于3cm时不建议行切除术，这种处理会对卵巢储备有损害[98]。关于ASRM提出的各种指南，它影响美国循证临床实践，这些指南在IVF前腹腔镜手术是否有意义提出了不明确的建议[87]。有意思的是这与ESHRE指南相反，在较大的巧囊大于4cm时，建议IVF前手术，这样利于取卵也有利于卵巢刺激成功[87]。尽管有差异，这些指南都推荐在内异症治疗中关于避孕药，孕酮和GnRH类似物（现代医药），都不是提高EMS患者生育力的有效措施，因此不能仅提倡这些方法[87，98]。其他组织的指南指出，包括韩国内异症协会与ESHRE的建议大概相同[99]。临床实践妇科委员会（Clinical Practice Gynaecology Committee）和加拿大妇产科协会执行和理事会（Executive and Council of the Society of Obstetricians andGynaecologists of Canada）提供的指南中，尽管提供了强有力的数据，但是关于治疗EMS性不孕的最佳方案没有提供针对性指南[100]。加拿大专家建议，无症状的EMS患者不应该接受现代医药或者手术治疗来提高生殖力[100]。与ESHRE的指南相同，加拿大妇科委员会强调腹腔镜手术对微小或轻度EMS能够提高妊娠结局，当与重度EMS相比时，手术治疗的好处尚不清楚[100]。但与ESHER不一致，而与ASRM相同，加拿大推荐大于3cm巧囊需要手术切除[100]。此外，加拿大指南关于IVF在EMS中作用尚不明确[100]。英国国家卫生与保健研究所（NICE）指南提出，在英国处理内异症相关不孕症时推荐EMS患者应该在IVF之前至少尝试2年自然受孕[101]，NICE指南也推荐EMS患者不应该接受现代药物治疗，因为这种经验不会提高自然妊娠率[101]。在同样的指南中，作者指出建议腹腔镜切除或者消融病灶，以及粘连松解术，这种做法会增加了自发性妊娠的机会[101]。而且，在治疗卵巢巧克力囊肿方面，NICE专家的建议与ASRM类似，强调腹腔镜卵巢囊肿切除术，会增加自然妊娠率[101]。NICE指南推荐在IVF之前不推荐使用腹腔镜手术来提高IVF结局[101]。但是，希腊人群数据表明没有明确诊断的EMS可能是不明原因性不孕的潜在病因，腹腔镜诊断和纠正潜在的病理，可以明显提高了这些病人的妊娠结局[1，2]。鉴于上述情况，尚不清楚哪种治疗方法可以改善卵母细胞和胚胎质量，提高生殖能力。腹腔镜处理内异症病症对恢复生育力的作用仍有争议。但是，全世界的指南指出在处理内异症相关性不孕中，目前现代药物治疗不能作为唯一治疗策略，因为它不能对患者受损的生殖系统有任何有益影响。
上述研究显示不宜对所有患者提供特定的治疗作为灵丹妙药或者“一刀切的治疗”方案。正如提到的，广泛的参数反应了病理生理的多样化的差异，以及EMS相关不孕症中的表型异质性[102]。由于多因素的发病机制[40]是最有可能的解释，或者应该对首先对患者进行更好的分类。因此，未来应该探索EMS相关性不孕的分子标志和个体化治疗方案。在EMS病人特征性分子谱获得后，EMS的诊断和后续治疗才得以进行。这并非根据症状的严重程度或类似CA125等这类非特异的生物标记物进行分类。此外，该疾病的传统分类本质上是模糊的，因为病变不可能是EMS生化活性的指标。按照这些方面来说，可以假设这些选项不能对所有内异症患者都同样有效，因为EMS有不同的潜在分子机制。使用新的生物标记物，依据病理生理特征来对EMS做更充分分类应是可行的。EMS的具体特征是确定分类方法的最佳途径。几十年来EMS一直是研究的焦点；但提出的许多基本问题仍远远没有得到解决。尽管EMS患病率很高，但研究人员和临床医生在EMS和EMS相关性不孕的最佳治疗和管理方面存在矛盾。这个研究展示了正在进行的EMS相关性不孕的研究结果方面存在相当大的差距。我们恳请科学界回归基础研究，旨在解决导致EMS表型的分子机制。本文侧重于探讨卵母细胞和胚胎受损机制方面，值得进一步深入研究。某些影响卵母细胞和胚胎的分子途径已经被认为是EMS相关性不孕的致病因素。例如，在EMS患者中报道线粒体含量低和线粒体异常率高，这一有趣现象需要更深入的阐释[103]。这远远超过“需要更多研究”这种陈词滥调。发表的文献中含糊的数据和矛盾的证据说明目前的研究设计严谨性是不够的。但是，这也可能表明EMS多因素性质阻碍了我们更好理解，然后产生了矛盾的结论。尽管这是在临床中经常遇到的妇科疾病，EMS仍然被各种假说包围，从而产生了未知的研究领域。深入研究目前关于EMS表现和生育能力损害的分子机制是必要的。EMS是一种复杂的系统性妇科疾病，其影响超出生殖系统。此外，我们需要重新调整和调查治疗方案，目的是解决EMS核心问题而不是针对症状学。为了做到这点，需要具有疾病发病的分子证据和数据。当考虑到导致卵母细胞和胚胎质量受损等强烈病理事件时，在ESM相关性不孕时，选择做IVF可能是徒劳无益的。为了解决这个难题，研究应该集中在深度分析EMS损害卵母细胞和胚胎分子基础。考虑到胚胎学家的观点，EMS患者不会总是出现卵母细胞和胚胎质量受损的模式，特别是当我们主要依靠形态学来评估卵母细胞和胚胎质量，能力和植入潜力。强调需要发现EMS的分子标记物，寻找潜在的分子机制，以评估卵母细胞和胚胎质量。本综述强调，氧化应激和免疫系统失调是EMS患者卵母细胞和胚胎能力受损两个主要的病理生理机制。有趣的是，已公布的数据表明这种有害影响与EMS的严重程度并非总是相关。考虑到上述情况，在精准医疗和个体化医疗时代，未来的研究应该基于发现报告氧化应激状态和免疫系统失调状态敏感性的工具。此外，这些生物标记物对识别EMS患者是必须的基础，以在他们诊断为EMS相关性不孕之前，从辅助治疗包括氧化应激治疗和/或药物控制免疫系统失调[104，105]中获益[104，105]。总之，有效分析EMS特点可能是管理这类复杂疾病缺失的环节。精准医学时代应该包括个体化治疗和避孕徒劳的IVF尝试。
