跑个漂亮的 Caspase-3 结果图，真的那么难吗？
快速 Get 要点：
凋亡过程中最重要的事件之一即是 caspase-3 的活化，但不少老师们检测不到 cleaved caspase-3，是什么原因呢？这种情况下我们该如何应对呢？该篇文章将展开分析。
划重点，Caspase-3 检测 7 大要点：
1. 合理的凋亡诱导处理方式：设置药物诱导时间和浓度梯度预实验，以确定特定细胞系中药物诱导 caspase-3 活化的最佳条件，并用 staurosporine #9953（1uM for 3hours）或 etoposide #2200（25 uM for 5 hours）处理 HeLa，NIH/3T3 或 C6 cells 作为 cleaved caspase-3 的阳性参照。
2. 贴壁细胞发生凋亡后会变得难贴壁，需离心收集所有的悬浮细胞。
3. 裂解样本过程中超声。
4. 足够的蛋白上样量：组织每孔 100ug，诱导的细胞每孔 20-30ug。
5. 16% 或 4-20% Tris-Glycine 胶检测 cleaved caspase-3。
6. 0.2um 孔径膜，湿转，70V（200-250mA）不超过 1.5 小时。
7. 表现优异的抗体。
正文
Caspase-3（CPP-32，Apoptain，Yama，SCA-1），半胱天冬酶家族成员之一，是凋亡的关键执行者，对许多关键的蛋白起着部分或全部的裂解作用，如核酶多聚（ADP-ribose）聚合酶（PARP）（1）及众多细胞骨架相关的蛋白、激酶以及 Bcl-2 家族中凋亡相关的蛋白等（2）。
Caspase-3 在肺、脾脏、心脏、肝脏、肾脏等中广泛表达，在大脑和骨骼肌中表达量稍低，在睾丸中表达量最低。同时在许多细胞系中都有发现 caspase-3 的表达，其中免疫相关的细胞中表达量最高（3）。但据报道，MCF-7 人乳腺癌细胞系中，因在 CASP-3 基因 exon 3 中存在 47bp 的缺失而不表达 caspase 3 蛋白（4）。
前体形式的 caspase-3 由一个前端功能区（prodomain）和一大一小两个催化亚单位构成。在特定的刺激比如配体受体互作、生长因子匮乏和细胞功能抑制剂等的作用下，未活化的酶原形式的 caspase-3 在 Asp-28/Ser-29（N 端功能前区）以及 Asp-175/Ser-176（大小亚基之间）被剪切活化，转变为活化的 p17 大亚基和 p12 小亚基片段。p17 和 p12 会二聚化，从而形成最终活化形式的 cleaved caspase-3（5，6）。
图一 Caspase-3 活化示意图（图片源自文献 Zhiyong Han et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 13432–13436）
凋亡过程中最重要的事件之一即是 caspase-3 的活化，因此 cleaved caspase-3 的检测是凋亡研究中的常用手段。但在以往的技术咨询中我们发现不少老师在检测 cleaved caspase-3 时遇到问题。经过大量数据总结我们发现，老师们之所以检测不到 cleaved caspase-3，最主要的原因还是样本中没有足够比例的凋亡细胞。这种情况下我们该如何应对呢？CST博士团队给您支个招，不妨翻翻实验记录，问问自己以下7个问题：
1. 我诱导凋亡的处理方式是否合理？
Cleaved caspase-3 仅仅存在于正在发生凋亡的细胞中，未发生凋亡，或已经坏死的细胞中是检测不到 cleaved caspase-3 的。因此，样本的诱导处理显得尤为关键。细胞系、诱导试剂的浓度、诱导的时间长短等，对最终发生凋亡的细胞数量及其中 cleaved caspase-3 的量都会产生很大的影响。所以，根据不同的细胞系，诱导试剂的浓度、诱导时间长短都需要进行适当的摸索。我们建议客户在检测到 procaspase-3 的前提下，做时间和浓度梯度预实验，以确定您的药物对您的细胞系的最佳诱导 caspase-3 活化的条件。CST 通常用 staurosporine #9953（1uM for 3hours）或 etoposide #2200（25 uM for 5 hours）处理 HeLa，NIH/3T3 或 C6 cells 作为 cleaved caspase-3 的阳性参照。
图二 使用 Caspase-3 Antibody 对未处理或经 Etoposide #2200 处理（25uM，5 小时）的 Jurkat 细胞，以及未处理或经 staurosporine #9953 处理（1uM，3 小时）的 NIH/3T3 细胞进行蛋白质印迹分析。（图源自CST Caspase-3 Antibody #9662 抗体说明书）
为什么所有的实验都要设置对照？无论是初高中刚接触生物学实验设计还是上研究生后发表 SCI 文章，老师们以及 reviewer 都会敲着 ‘黑板’ 强调强调再强调，每一个实验都必须有对照！因为设置适当的阴性、阳性甚至空白对照对于实验结果的准确、有效阐释至关重要！阅历丰富的老师应该和笔者一样深有感触：实验条件、样本类型之间生物学条件、试剂特异性甚至研究人员的差异都可能产生不一致的结果，导致不准确的结论。
2. 我的细胞系是贴壁细胞吗？
因为贴壁细胞在发生凋亡后，有可能会变得比较难贴壁，所以有必要通过离心收集所有的悬浮细胞，一并混到刮下来的贴壁细胞中一起裂解。
3. 在裂解细胞过程中我是否有超声？
CST 研发科学家做过对照试验，与不超声相比，超声能最大程度的/均一稳定的提取 caspase-3，得到更强的信号。因此，CST 科学家建议在加入 1X 细胞裂解液（稀释成 1X 的 Blue Loading buffer Pack #7722 或 Red Loading buffer Pack #7723 或 Cell Lysis Buffer (10X) #9803 或 RIPA Buffer (10X) #9806）后、上样前对所有的样本进行超声处理。超声条件：在 35%-40% 的功率输出条件下破碎 3 次，每次 10 秒，各次之间间隔 10 秒，冰上操作。但不同的超声仪器有不同的性能，应根据生产商的建议进行个性化优化。如果您没有探头超声仪，也可用细的注射器针头反复吹打来破碎。
4. 我的蛋白上样量足够吗？
对于组织提取的蛋白，由于只有一小部分细胞可能会发生凋亡。因此，CST 科学家建议每个孔上样 100ug。而对于诱导的细胞系提取的蛋白，20-30ug 就足够了。
5. 我用的跑胶条件合适么？
我们通常强烈建议用 16% 或 4-20% Tris-Glycine 胶检测 cleaved caspase-3（17, 19kDa）。如果是用 Bis-Tris 胶，最好用更适应于小分子量电泳的 MES 跑胶缓冲液，而不是 MOPS 跑胶缓冲液。
6. 我转膜用的膜孔径大小对么？
对于小分子量的靶标蛋白（比如 cleaved caspase-3），避免过转非常重要。我们推荐的转膜条件如下：0.2um 孔径膜，湿转，70V（200-250mA）不超过 1.5 小时。转膜液 25mM Tris，192mM Glycine，和 20% methanol。0.2um 的孔径能最大程度的减少转膜过程中小分子量蛋白的丢失。另外，也有文献表示，使用戊二醛固定 NC 膜 30min，能稳定 caspase-3 与 NC 膜的结合，从而促进 caspase-3 的检测（7）。
7. 我使用的抗体是最适合的么？
除了合理的样本诱导及优化的实验操作，选择表现优异的抗体尤其重要。但各大商家推出了各种不同货号的 caspase-3 抗体，老师们不禁要苦恼：我该如何选择我需要的抗体呢？
2018 “年度最高引用抗体品牌” CST 抗体公司建议您：通常情况下，做 WB 检测时，用既能识别全长 caspase-3（也就是非活性的 procaspase）又能识别剪切、活化 caspase-3 的抗体是更加明智的选择。因为这些抗体（如 CST 公司的 #9665 和 #14220）识别的抗原表位共同存在于全长的 procaspase-3 和 cleaved caspase-3 蛋白中，而检测全长的 procaspase-3 能作为一个好的抗体内部参照，在出现无法检测 cleaved caspase-3 时，帮你直观的判断是抗体出现问题还是剪切诱导方式需要优化。对于 WB 应用，我们一般优先推荐能同时检测全长和剪切形式的 caspase-3 抗体来进行 WB 检测。同时，cleaved caspase-3 特异抗体更适合需要在一群细胞中观察凋亡细胞的实验方法，如 IHC、IF-IC 和/或是 Flow。
|
WB检测更推荐 |
|||
|
# |
产品名称 |
应用 |
反应性 |
|
WB, IP |
H, M, R, Mk |
||
|
WB |
H, M, R, Mk |
||
|
WB |
H, M, R, Mk |
||
|
WB |
H |
||
|
WB, IP, IHC |
H, M, R, Mk |
||
|
做WB遇到问题？不妨试试我们的caspase-3阳参吧 |
|||
|
WB |
|||
|
WB |
|||
|
IHC 检测更推荐 |
|||
|
# |
产品名称 |
应用 |
反应性 |
|
WB, IP, IHC, IF, F |
H, M, R, Mk |
||
|
WB, IP, IHC, IF, F |
H, M, R, Mk |
||
|
IHC, IF, F |
H, M |
||
|
SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit |
IHC |
H, M |
|
|
做IHC遇到问题，不妨试试我们提供的阳性对照切片吧 |
|||
|
caspase-3相关的小包装抗体集合 |
|
|
# |
产品名称 |
|
其他 |
|||
|
# |
产品名称 |
应用 |
反应性 |
|
WB |
H, M, R, Mk |
||
|
IHC |
H |
||
|
WB, IHC |
H |
||
|
H |
|||
|
H, Mk |
|||
|
H |
|||
|
H |
|||
您若有其他自己总结的比较好的实验经验，欢迎留言或联系我们分享。
【参考文献】
（1） Fernandes-Alnemri,T. et al. (1994) J Biol Chem 269, 30761-4.
（2） Feng Y. et al.(2005) Int J Oncol. 27(3):699-704.
（3） http://www.uniprot.org/uniprot/P42574.
（4） Janicke RU et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:9357–9360.
（5） Nicholson,D. W. et al. (1995) Nature 376, 37-43.
（6） Tewari M, et al. Cell 81: 801-809, 1995.
（7） Notes & Tips / Anal. Biochem. 415 (2011)203–205