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The Construction and Analysis of ceRNA Network and Patterns of Immune Infiltration in Colon Adenocarcinoma Metastasis结肠腺癌转移中ceRNA网络和免疫浸润模式的构建与分析
一、 研究背景
结肠腺癌（COAD）是消化系统中的一种恶性肿瘤，远处转移导致预后不良。转移特异性ceRNA（竞争性内源性RNA）和肿瘤浸润的免疫细胞可能与肿瘤的预后和远处转移有关。ceRNA网络认为任何带有miRNA应答元件的RNA转录本都可以阻断miRNA对其靶标的抑制，从而调节基因表达并协调生物学过程。此外，肿瘤浸润免疫细胞也被认为在COAD生长，进展和转移中起着关键作用。
二、 分析流程
三、 结果解读
1.鉴定显著差异基因
作者分析了TCGA中459个原发性COAD RNA-seq的HTseq-count和FPKM数据，包括了91例远处转移的原发性COAD和368例无转移的原发性COAD。过滤掉非结肠癌特异性表达基因（即在对照组和实验组中均未检测到的基因）后，使用edgeR基于FDR P-value < 0.05, the log(fold change) > 1.0或< −1.0鉴定差异表达的RNA，包括lncRNA，miRNA和mRNA。筛选得到203个蛋白编码基因（图1.CD），22个lncRNA（图1.EF），18个miRNA有差异表达。
图1.原发和远处转移结肠癌中显著差异的基因和lncRNA
2.ceRNA构建网络及生存分析
作者从miRTarBase(http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php)下载了基于实验验证的关于miRNA-mRNA相互作用信息，从lncbase v.2(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=lncbasev2/index-experimental)下载了lncRNA-miRNA的相互作用信息。
作者对lncRNA和mRNA调控的miRNA进行了超几何分布检验和相关分析，并使用Cytoscape构建了一个由13个基因组成的ceRNA网络（4个lncRNA，4个miRNA和5个mRNA），这些基因组成4对lncRNA–miRNA和5对miRNA–mRNA（表1，图2.A）。使用Lasso Cox回归和Kaplan–Meier生存分析检验了结肠癌生物标志物与预后的相关性，在ceRNA网络中仅鉴定出两个重要基因（SLC2A3，P = 0.029；hsa-miR-125b-5p，P＝ 0.022，图2.BC）。
基于13个基因的Cox模型，作者建立了nomogram以预测COAD患者的3年和5年总生存率（图3.AB），并用Lasso回归检验这些基因的重要性（图3.CD），ROC曲线（图4.E，3年-AUC：0.693；5年-AUC：0.673）和校准曲线（图3.F）均显示了列线图较好的预测精度。
表1.ceRNAs网络的超几何检验和相关分析结果
图2.ceRNA网络构建与ceRNA网络重要成员的生存分析
图3.多元Cox回归（A），nomogram图（B），Lasso回归和ROC曲线（C-F）
3.转移性和非转移性原发COAD的肿瘤浸润免疫细胞的组成
作者通过CIBERSORT算法评估了COAD中重要的肿瘤浸润免疫细胞组成，直方图（图4.A）和热图（图4.B）显示静息的记忆CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞M0和巨噬细胞M2在原发性肿瘤和远处转移组织中显著表达高表达。此外，Wilcoxon秩和检验表明滤泡辅助性T细胞，幼稚B细胞，Tregs，巨噬细胞M0和嗜酸性粒细胞，总共5种细胞在远处转移和原发性COAD之间的细胞比例有显著差异（图4.C）；激活的记忆CD4+T细胞，浆细胞，CD8+T细胞，激活的树突状细胞，静止的树突状细胞，巨噬细胞M1，静止的肥大细胞和激活的肥大细胞，总共8种细胞在远处转移和COAD复发之间存在差异（图4.D）。
图4.CIBERSORT算法评估的结肠癌免疫细胞的组成、远处转移和复发相关的肿瘤浸润性免疫细胞的鉴定
4.基因和免疫细胞对预后和远处转移的复合表达和共表达分析
首先，作者对14种重要肿瘤免疫细胞构建了Cox回归模型（图5A），并用列线图显示了对3年和5年总生存率的影响（图5B）。此外，用ROC和校准曲线评估了nomogram图的准确性（3年生存期的AUC：0.708；5年生存期的AUC：0.780）（图5CD）。
图5.多元Cox回归（A），nomogram图（B），Lasso回归和ROC曲线（C-F）
接着作者对肿瘤浸润免疫细胞之间进行共表达分析（图6A）。而滤泡辅助性T细胞，巨噬细胞M0，激活的树突状细胞和单核细胞（K–M生存分析：P = 0.041）均显示与临床特征显著相关（图6B–G）。
图6.免疫细胞共表达分析及重要细胞与临床特征相关性分析
最后，图7对ceRNA网络和免疫细胞中关键成分进行共表达分析，作者发现了滤泡辅助性T细胞和hsa-miR-125b-5p（R = -0.200，P <0.001），巨噬细胞M0和hsa-miR-125b-5p（R = 0.170，P<0.001）以及巨噬细胞M0和FAS（R =- 0.370，P <0.001）的显著相关。
图7.肿瘤浸润免疫细胞与ceRNA网络关键成分之间共表达分析的结果
5.初步临床标本验证
上一步分析得到免疫细胞中滤泡辅助性T细胞和巨噬细胞M0与ceRNA网络显著相关，所以作者在这一节结合初步临床样本进行IHC验证。BCL6，CD3，MME，CXCL13和ICOS是滤泡辅助性T细胞中报道最多的五个标记，CD68是巨噬细胞M0的标记。20个COAD样本IHC的结果表明，FAS，NES，CD3，CD68和BCL6的蛋白质在转移和无转移的COAD中有显著差异（图8A），并进行了非参数检验验证（图8B–H）。热图显示了ceRNA网络中FAS，NES，CD3，BCL6，CD68和关键miRNA（miR-320a-3p，miR-320a-5p和miR-125b-5p）的表达水平（图8I）。另外，CD68和FAS（R = -0.500），CD68和NES（R = -0.650）显示出共表达趋势（图8J），验证了FAS、NES与巨噬细胞M0的相关性。
图8.初步临床标本验证的结果
6.多维验证
图9描绘了关键ceRNA通过影响免疫细胞分化和活动来影响肿瘤转移进展的机制图。为了验证重要的ceRNA和免疫细胞的重要基因和蛋白质表达，作者从CellMarker数据库中检索了关键免疫细胞的表面标记，并在多个数据库（Oncomine，The Human Protein Atlas，Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA），LinkedOmics，String，Lncrna2target V2.0，exoRBase和PROGeneV2）验证表达。
经上面的分析，作者认为FAS和滤泡辅助性T细胞是重要的ceRNA和肿瘤浸润免疫细胞，所以在这些数据库中比较了FAS和滤泡辅助性T细胞相关基因的表达。Oncomine表明与正常结肠相比，原发性COAD中FAS的表达较低，BCL6，CXCL13，CD3E和MME在原发COAD与正常组织之间存在显著差异。GEPIA结果表明FAS与CXCL13和FAS与BCL6在COAD和正常组织之间的相关性均显著不同。LinkedOmics结果表明，FAS和hsa-miR-125b-5p与COAD的肿瘤纯度和肿瘤分期显著相关。此外，EGFR和CXCL13（P = 4.536E-5），CD3D（P = 1.511E-13），CD3E（P = 4.536E-5）之间的相关分析也得出了显著结果。The Human Protein Atlas结果表明，在COAD和正常结肠中，FAS，CD3G和MME存在显著差异。String结果显示了FAS，CD3D和CD3E的蛋白质-蛋白质相互作用网络。
此外，另有研究报道ceRNA通过肿瘤细胞分泌的外泌体作用于免疫细胞导致表型。因此，作者通过exoRBase数据库在外泌体的RNA-seq数据中验证了关键lncRNA（LINC01116）和mRNA（FAS和NES）的表达水平。
图9.关键ceRNA和免疫细胞的推测机制图
在两个独立的GEO数据集中（GSE28814、GSE28722），FAS和NES差异表达的患者无转移生存（MFS）（图10）均具有显著差异。此外，将具有585个COAD样品的GSE39582用于CIBERSORT的验证（图11A）。结果表明，巨噬细胞M2对COAD具有显著的预后价值（图11B）。此外，通过多变量Cox回归模型的公式计算每个COAD患者的风险评分，风险线和风险散点图显示了所有COAD患者的风险评分分布（图11C–D）。Kaplan-Meier生存曲线表明，风险评分对COAD患者具有预后价值（图11E，P <0.001）。ROC曲线（AUC = 0.698）说明了多元Cox模型的区分度（图11F）。
图10.GSE28814和GSE28722对无转移生存期（MFS）的独立数据集验证
图11.GSE39582对CIBERSORT的独立数据集验证
小结
本篇文章作者探索得到了1个显著差异表达的lncRNA（LINC01116），1个显著差异表达的miRNA（hsa-miR-125b-5p），2个显著差异表达的mRNA（FAS、NES），8个与肿瘤复发相关的免疫浸润细胞，5个与远处转移相关的免疫细胞。此外，还鉴定了与COAD转移相关的3对重要的生物标志物：滤泡辅助性T细胞和hsa-miR-125b-5p，巨噬细胞M0和hsa-miR-125b-5p以及巨噬细胞M0和FAS。
作者在这篇文章中将ceRNA网络与免疫浸润分析结合在一起，并加上了临床样本和外部多维数据的验证，论证思路非常简单，将ceRNA网络换成不同的RNA再结合不同的免疫细胞分析，又是一篇新文章了！