感染性疾病症候群病原体组合检测方法及其临床应用中的问题与挑战
一、传统的病原体检测方法及存在的问题
传统的病原体检测方法包括：形态学、培养、免疫学和分子生物学检测。形态学检测简单快速、成本低廉，仅适用于检测细菌、真菌检测，难以检测病毒。培养方法可获得病原体，可进一步做种属鉴定和药敏试验，是感染病诊断的“金标准”，但费时、费力，且能检测的病原体种类较少。免疫学检测是根据抗原抗体特异性结合原理间接诊断病原体感染。传统分子生物学检测技术以PCR为代表，是通过合成特异性引物检测病原体靶基因[1]。由此可见，形态学和培养方法一次试验可检测多种病原体，但敏感性较差，能检测的病原体种类较少；免疫学和PCR方法虽有较高的敏感性和特异性，能检测的病原体种类较广，但为靶向检测，即一次试验仅能检测一种病原体，诊断效率较低。由于感染性疾病缺乏典型的症状和体征，相同的症状可能由不同的病原体引起，也可能由几种病原体混合感染引起，逐一进行病原体检测工作量大、费时长，可能延误诊断[2]。
二、症候群检测方法及优势
近些年，随着分子诊断技术，特别是多重PCR技术（能在一个样品中检测几种目标）和一体化检测（微流控）技术的使用，症候群检测（Syndromic Approachtesting）得到了快速发展。这种诊断方式不同与以往对可能的病原体单一靶向检测的模式，而是从患者的症状和表征出发，涵盖症候群感染相关的常见病原体组合，一份样品、一次检测就可以诊断或排除多种病原体，显著提高了诊断效率。
世界卫生组织（WHO，World Health Organization）最早于1991年提出了关于症候群检测的概念“Syndromic case management”[3]。WHO在2004年总结了症候群病例管理的关键特征如下[4]：（1）问题导向性（它体现了患者的症候群）；（2）具有高度灵敏性，一次性涵盖更多的病原体，不会漏掉多种病原体混合感染；（3）在患者第一次就诊时就进行精准治疗；（4）让疾病（STI）的诊疗具有更高的可及性，可以在初级的医疗机构中进行；（5）使用流程图通过有逻辑的步骤指导卫生工作者。症候群检测的主要优势总结如下：
1. 针对症候群进行检测项目的设计，同时涵盖多种靶标：同一症候群通常可能由多种病原体引起，例如呼吸道感染可能由细菌，病毒，非典型病原体引起；血流感染可能由细菌，真菌引起，同时更需要考虑多重耐药菌（耐药基因）的检测；这就要求症候群检测不能是简单的某几种病毒进行组合或者细菌组合，而是要考虑到症候群常见的感染病原体，同时涵盖细菌、病毒和耐药基因等；这样才能够一次性为临床提供症候群相关病原体更全面的诊断和治疗信息。
2. 生物安全性好，技术具有更高可及性：传染性疾病患者的样本中病原体具有不确定性，操作过程中存在较大的生物安全风险。随着微流控技术的成熟应用，一体化的设计可以在同一个测试条中完成从原始“样本进”到最终“结果出”的全过程[5]。操作过程极大的简化，不再需要繁琐的人工操作来完成试剂制备，加样，PCR扩增等步骤。一方面提高了生物安全性，减少了检测过程中样本污染和人员感染的风险；另一方面提高了技术的可及性，降低了对操作人员和环境的要求，不再要求严格的实验室三区分区和技术熟练的操作人员，拓展了技术的使用空间，可以在更基层的医疗机构中应用；也可以不受时间限制，用于急诊检验[6]。
3. 检测速度快，可以使患者在第一时间得到治疗：一体化的检测通常会将反应所需的试剂和实验所需的质控同时包含在一个容器中，对整体的操作流程进行标准化，避免了不必要的重复，通过优化反应体系，整体检测时间大大缩短，例如，生物梅里埃公司的FilmArray RP2 Panel仅需要45分钟即可完成从样本到多种病原体检测结果报告的全过程[7]；赛沛公司的GeneXpert可以在45分钟左右提供甲流、乙流以及呼吸道合胞病毒的检测结果。此外，操作的简化使得相应检测标本可随到随做，无需按照传统的批次流程操作，而是根据患者的症候群进行全面的病原学诊断，从而使得患者能够在第一时间得到治疗。
三、常见感染性疾病症候群及病原体
1. 呼吸道感染症候群：呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管、支气管和肺组织等呼吸系统并引起相应症状。主要表现为发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难等。呼吸道感染通常由病毒、细菌、非典型病原体等引起，除了甲型流感和乙型流感之外，其他多种病原体也能造成呼吸道感染，比如鼻病毒、肠病毒、冠状病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、肺孢子菌、金黄色葡萄球菌等[2]。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案试行第八版》[8]中提到，“新型冠状病毒肺炎主要与流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原体感染鉴别。”尤其对疑似病例要尽可能“采取包括快速抗原检测和多重PCR核酸检测等方法，对常见呼吸道病原体进行检测。”治疗时必须明确引起感染的病原体以选择对应的治疗方案。呼吸道感染是临床的常见病，不同感染场所（如社区感染、医院感染）、不同季节性，不同年龄、不同基础疾病（如器官移植、糖尿病、艾滋病）患者感染的病原体各不相同，如社区获得性呼吸系统感染的主要病原体为病毒、支原体、衣原体、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等，而医院获得性呼吸道感染的主要病原体为细菌，尤其是耐药性细菌，如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等。一项针对儿童患者呼吸道感染的流行病学研究发现：肠病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒是造成儿童急性呼吸道感染的主要病原体。
2. 胃肠道感染症候群：胃肠道感染症候群主要表现为腹痛、腹泻、呕吐等，常见的病原体包括细菌（如弯曲菌、志贺菌、沙门菌、难辨梭菌、小肠结肠炎耶尔森菌、弧菌、致病性大肠埃希菌），病毒（如腺病毒、诺如病毒、轮状病毒、星状病毒）和寄生虫（如隐孢子虫、环孢子虫、痢疾阿米巴、兰氏贾第鞭毛虫）等。急性腹泻往往起病急骤，特别是在婴幼儿中的发生率较高，并且症状往往较成人更为严重。尤其是对于5岁以下的婴幼儿，急性腹泻可引起脱水和电解质紊乱，甚至威胁患儿生命。临床上对于婴幼儿、老年人、免疫缺陷患者、以及有过疫区接触史的高危人群，快速准确地诊断导致急性腹泻的病原体，有重要的临床意义。
3. 血流感染症候群：血流感染症候群主要表现为畏寒、发热，是临床急症，病情严重、死亡率高。有数据显示脓毒症患者如果能在1小时内确诊，并正确使用抗菌药物治疗，其存活率可提高到80%；而每延误1小时治疗，存活率将会降低7.6%。对脓毒症患者精准地使用抗菌药物不仅需要及时明确感染的病原体，也需要了解病原体对抗菌药物的耐药性。当前已经有数种商品化的血流感染症候群相关试剂上市，可以从阳性血液培养瓶中直接检测多种微生物以及选择耐药基因[9][10]：如FilmArray BCID测试条（BioFire Diagnostics，LLC）（于2013年获得FDA批准/批准）可检测金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、肠球菌、产单核细胞李斯特菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、粘质沙雷菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、mecA基因、vanA/B基因、KPC基因等。
4. 脑炎脑膜炎症候群：脑炎脑膜炎症候群主要表现为发热、头痛、头晕、呕吐等，往往起病急，临床表现多样，后遗症和死亡率较高。常见的病原体有：大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、产单核细胞李斯特菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、巨细胞病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒1（HSV-1）、单纯疱疹病毒2（HSV-2）、人疱疹病毒6（HHV-6）、人肝炎病毒、水痘带状疱疹病毒（VZV）、双埃可病毒、新型隐球菌（新生/格特）等。目前脑脊液培养虽然依旧是病原体诊断的“金标准”，但由于其阳性率低、对专业技术要求高、报告时间长（24-48小时），敏感性易受先前使用抗菌药物的影响，易造成误诊或漏诊，延误治疗。分子生物学检测与培养方法相比，可以更快地进行诊断，尤其是对已使用抗生素的细菌感染患者检测阳性率更高，同时可以检测单纯疱疹病毒1型（HSV-1），HSV-2、肠病毒和虫媒病毒等特殊病原体感染，已被认为是中枢神经系统感染诊断的首选方法。
四、目前常见的商品化症候群检测方法及检测原理
1. 生物梅里埃FilmArray系统：Biofire（生物梅里埃旗下公司）公司的 FilmArrayTM 系统是一个技术新颖且高度整合的实时多重PCR仪器，其采用了巢氏多重PCR（Nest Multiplex PCR）的原理，在一个一次性使用的封闭测试条中通过高效的微流控反应体系一次性完成原始样本核酸提取，两轮PCR扩增反应，熔解曲线分析和检测结果报告的全流程[11][12]。根据不同测试条组合，1小时左右可以报告至多43种病原体/靶标结果，涵盖病毒，细菌，真菌和耐药基因靶标。
检测平台上提供了两种选择，FilmArray2.0及高通量的FilmArray Torch两个仪器平台。FilmArray2.0可以使用一台电脑同时连接1～8台FilmArray检测仪，可以根据实验室需求进行配置；FilmArray Torch系统则是2017年推出的仪器，采用触屏操作无需外接电脑，模块化设计可以至多提供12个操作模块（如图1），每天进行264个患者样本的检测，能够在更紧凑的空间中提供更高通量的选择。
自2013年获得首个FDA认证以来，目前已相继获得FDA及CE认证的相关检测试剂已有呼吸道感染测试条（FilmArray RP Panel，RP2 Panel，RP2.1 Panel）[7][13]，胃肠道感染测试条（FilmArray GI Panel），血流感染检测测试条（FilmArray BCID Panel），脑炎/脑膜炎测试条（FilmArray ME Panel），肺炎测试条（FilmArray Pneumonia Panel ）[14]等。
其在产品中贯彻了症候群检测的概念，具备以下特性：操作简单，仅需200μl左右原始样本即可进行检测；只需1小时左右的检测时间，就可以提供14至43种靶标的结果，涵盖不同症候群所需；核酸提取，PCR扩增，产物检测在一个封闭的测试条中完成，有效避免污染，具有良好的生物安全性；采用巢氏多重PCR原理，结合熔解曲线分析，具有良好的灵敏度和特异性；测试条中内置样本处理质控和PCR反应质控，并且对每个靶标进行三次重复，可靠性高。
2. 赛沛（Cepheid，Danaher旗下公司）GeneExpert系统：赛沛公司创立于1996年，在2005年GeneXpert PCR分析仪和Xpert GBS（B族链球菌）测试盒获得FDA认证，是世界上第一个将样品制备、扩增与检测完全整合的定量PCR仪，即通常意义所说的“样本进，结果出”的一体化检测。
赛沛的GeneXpert系统是一个高度整合的使用一次性卡盒对临床样本中病原体进行直接检测的实时PCR仪器。样本处理和去污染，DNA提取，扩增和基因位点检测在同一个卡盒中完成。可以在2小时内获得结果，并且只需很少的人工操作步骤。该系统由通量从1到96的GeneXpert检测仪以及用于操作和解读结果的电脑构成[15]。
目前，GeneXpert拥有的检测卡盒包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），艰难梭菌（C.Diff），B群链球菌（Group B Streptococcus), 肠道病毒，STI（沙眼衣原体淋病奈瑟菌），耐万古霉素肠球菌(VRE)，Flu A/B+RSV以及MTB/RIF检测。受到荧光通道的限制，GeneXpert通常只能同时报告2-6种靶标。应用在特殊的症候群中，特别是耐药结核的检测得到了广泛的认可，有效推动了耐药结核的检测和诊疗决策的优化[16]。
3. Nanosphere公司的（Luminex旗下公司）Verigene系统：Nanosphere公司的Verigene系统使用了金纳米颗粒探针技术，通常直径13-20nm的纳米颗粒携带特定数量靶位点特异性的寡核苷酸或抗体，应用在阵列和扩增两种方法中。纳米颗粒相对于荧光基团灵敏度得到了显著提高[10]。
Verigene系统不同于前面介绍的两种平台，采用的分体式设计。自动的核酸提取和扩增在Verigene Processor SP上完成。在Verigene测试卡盒中核酸靶标是通过包含特异性寡核苷酸片段和金纳米颗粒探针的微阵列进行杂交捕获。最终的探针信号放大和自动定性分析在Verigene Reader（读取仪）上完成。Verigene目前可以提供的检测卡盒涵盖了血流感染，胃肠道感染和呼吸道感染，可以在两小时以内提供检测结果。其中血流感染的检测将血培养阳性样本中革兰阳性菌和革兰阴性菌放在不同的卡盒中进行检测。
4 . 海尔施基因呼吸道13 种病原体检测（ResP13）：症候群检测相关的产品已经有国产产品获得批准。海尔施基因的13项呼吸道病原检测试剂于2018年11月获得中国药监局的注册证。该产品可同时扩增和检测11种病毒以及肺炎衣原体、肺炎支原体等共13种常见呼吸道感染相关病原体[17]。通过将特异性多重PCR与毛细管电泳的检测相结合，有效实现了对13种常见呼吸道感染病原体的快速诊断。整体报告时间大约在4-5个小时左右。相对于免疫学方法而言，它有着更高的病原检出阳性率（图6）。
5. 微流控芯片技术：此外近些年还涌现出了一系列新的平台，例如iCubate公司在2017年，其检测系统iC-System™和iC-GPC Assay™（革兰氏阳性菌检测试剂盒）先后通过美国FDA和欧盟CE认证[18]，并且已经和广州万孚公司合作推出BoxArray平台；STAT-dx公司（QIAGEN公司2017年底收购）具有diagCORE检测平台；博世（Bosch）医疗推出了vivalytic检测平台。国内企业也大力的投入开发症候群分子检测技术，如博奥生物的微流控芯片检测系统，奥然生物的Galaxy系统等。均有不同的症候群检测试剂盒问世。
五、症候群检测技术在感染病诊断中的应用
目前，研发症候群检测技术的公司不断增加，一方面，是因为通过核酸检测诊断病原体已经具有成熟的技术基础；另一方面，使用症候群检测方式一次性同时检测多种病原体的感染性疾病诊疗模式已经得到医疗行业的广泛认可。随着症候群检测技术在感染病诊断中的应用不断深入，从单一的呼吸道症候群拓展到胃肠道、中枢神经等多种感染症候群。相较于传统的病原学检测模式，症候群检测给感染病快速诊断和临床治疗带来了切实的获益。2020年Miller综述了症候群检测方法的临床应用价值见表1。
症候群检测的临床应用总结如下：
1. 缩短病原体报告时间，提升病原体的检出率，提高混合感染检出能力：使用症候群病原检测的方式可以有效提高病原体的检出率，特别是针对脑脊液这种十分难得的样本[20]。Arora等使用FilmArray脑炎/脑膜炎测试条检测了62份来自0-3个月的疑似脑膜炎患儿的脑脊液样本，并与脑脊液培养的结果进行了比对[21]。其中12份来自9名患儿的样本FilmArray检测结果为阳性（10例无乳链球菌，2例大肠埃希菌），而脑脊液培养结果中仅有5例阳性。脑脊液培养呈阴性的7例样本，均来自之前使用过抗菌药物治疗的患儿。Lopez等报道了使用FilmArray脑炎/脑膜炎测试条后发现了4例新生儿人埃可病毒感染[22]。这4名患儿血培养和脑脊液培养结果均为阴性。
此外，症候群检测的方式也有效提高了多病原体混合感染的检出率。Crotty等在2015年进行了一项纳入284名以病毒性肺炎入院的成人患者进行研究[23]，发现其中29.4%（84/284）的患者存在有多种病原体共感染(涵盖病毒，细菌，真菌之间的感染)，其中5%（14/284）的患者通过FilmArray多重巢氏PCR的方法检出一种以上的病原体感染，并发现多重病原体感染与院内死亡率具有相关性（OR* =4.87， p =0.04）。
2. 及时有效的病原学报告，促进抗菌药物合理使用，促进感染控制，改善患者预后：来自Geisinger医学中心的R. Martinez在一项纳入736例成人ICU患者的回顾性研究中[24]，通过对比FilmArray呼吸道检测和常规的分子检测，发现使用症候群检测方式对患者进行随到随检（first-in，first-out）后，检测效率得到提升，呼吸道病原体检测结果平均报告时间从35小时缩短至4.6小时，患者生存率从72.8%提升至79.8%，ICU住院时长从9.2天缩短至6.2天，总住院时长从14.3天缩短至6.2天，抗菌药物使用天数从9.1天缩短至7.2天，并为每个患者平均节省超过8000美金医疗成本。在以色列特拉维夫进行的一项回顾性队列研究中，对比了FilmArray使用前后的社区获得性细菌性脑膜炎病例（使用过抗菌药物经验治疗，细菌培养阴性），结果表明：窄谱抗菌药物在研究组中使用时长占比显著高于对照组（78% vs. 40%），另外对于脑膜炎奈瑟菌感染患者的密切接触者的预防比例也显著提高（50% vs. 4%）[25]。
3. 优化诊疗流程，带来临床和经济上的获益：来自梅奥中心的Ramanan等讨论了症候群检测在临床微生物检测中的应用，对于腹泻大于7天，有旅行史或有血样便/发热/住院等特殊症状的患者中推荐进行多重胃肠道病原体的检测[9]；（具体流程见图8），具有显著的临床应用价值。
Duff等在对于儿童脑炎/脑膜炎患者的卫生经济学研究中指出，对所有具有症状的患儿进行症候群检测相对于常规方法或对特定人群进行症候群检测可以获得更显著的经济获益[26]。对所有疑似病例进行FilmArray检测（节省3481美金/患者）比针对脑脊液异常的患儿进行检测（节省2157美金/患者）可以节省更多时间和肺炎。
六、症候群检测方法存在的问题和挑战
全新的症候群检测让感染性疾病诊疗更精准，更快速，为临床提供了检测病毒，细菌、真菌及耐药基因的全面解决方案。新的技术带来了新的诊疗观念，使感染性疾病诊断从以病原体为中心转变为以患者临床症状为中心。但是症候群检测这一新兴的检测方式，目前仍然存在一些问题需要克服。（1）受到各个厂家的检测组合和检测技术限制，不同公司产品在在靶标设计和性能表现上各有差异，需要更多的临床数据来验证。如何有效的整合现有实验室检测手段，优化检测组合和检测流程十分重要。（2）症候群病原检测灵敏度高，检测的病原体种类多，但对于非无菌部位的标本，如呼吸道标本，检出病原体尚不能判断该病原体是定植菌还是致病菌？对于检验人员来说，如何将症候群检测与传统检测方法结合，合理应用，综合解读，无疑是一个新的严峻挑战。（3）症候群检测病原体的种类通常是根据流行病学数据，涵盖常见的病原体种类，而非所有病原体，不能检测少见病原体感染，也不能检测新发病原体感染。
参考文献略
注：本文来源于《临床实验室》杂志2020年第10期“感染性疾病”专题