PCR实验结果总不对?耗材是个坑!

“众所周知,PCR是生化实验室基本的实验方法。”实验结果却总是不尽如意,有可能是PCR塑料耗材微量的污染,或者是抑制剂的引入造成的实验干扰。还有一个很重要的原因:耗材选择不当也会对实验结果造成很大的影响。

影响PCR实验结果得原因有很多:通常有以下7种。
1、引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度;
2、 酶及其浓度 ;
3、dNTP的质量与浓度;
4、模板(靶基因)核酸;
5、Mg2+浓度;
6、温度与时间的设置;
7、循环次数;
8、设备、耗材等。
在众多影响因素中,耗材是一个非常重要、也极容易被忽视的因素之一。
PCR耗材类型众多:8连管、低容管、标准管、无裙边、半裙边,全裙边,升孔缘等一系列的PCR及qPCR板,选择起来非常困难,在这中间存在许多具有共性的问题,小析姐对这些问题进行了汇总。我们一起来看看大家在选用PCR耗材时都遇到了哪些问题,又该如何解决呢?

常见问题及解决办法

一、PCR耗材为什么一般都是PP材质的呢?
答:PCR/qPCR耗材一般都是聚丙烯(PP)材质,因其为生物学惰性材料,表面不易于粘附生物分子,且有着良好的化学耐性,及温度耐受性(可121度高压灭菌,也可以承受热循环过程中的温度变化)。这些材料通常会与试剂或者样品直接接触,因而在生产制备过程中需要选用高质量的材料和良好的加工工艺。
二、不同体积的PCR 管/板,我该怎么选呢?
答:PCR管的体积大多数都可以满足PCR反应要求。但是在满足实验要求的基础上,优先推荐选用低容管哦。因为低容反应管/板有着较小的上方空间,可提高热传导率并降低蒸发。而且在加样时,需要避免加样过量或过少。过量会导致热传导率下降,溢出及交叉污染,而加样过少可能会造成样品蒸发损失。大家可依据具体的实验要求选用更合适的产品。
常见反应管规格及体积:
单管/联管:0.5mL,0.2mL, 0.15mL
96孔板:0.2mL, 0.15mL
384孔板:0.04mL
三、为何有的PCR管是平盖,有的是凸盖呢?
答:当样品量较少时,都会优先选用单管或者连管。但是当反应体积需求较大时,单管可达到0.5mL呢。平盖和凸盖各有优点呢,可参考下面的信息。
四、不同颜色的PCR 管/板,我该怎么选呢?
答:对于普通的PCR反应选用透明或者彩色的PCR管都是可以的,而彩色透明的PCR管更有助于进行样品分类管理哦。

但qPCR更推荐选用优质的白色PCR耗材。

由于qPCR需要实时定量检测荧光信号强度,更需要灵敏、精确的荧光信号传递。与传统的透明PCR产品相比,白色PCR产品可最大程度地反射荧光信号,减少孔间信号交叉污染,可优化实时荧光定量PCR的结果。


五、PCR板/管材质厚度不一,是不是厚点的稳定性更好呢?
答:一般分为无裙边、半裙边、全裙边。
无裙边板可适用于大多数的PCR仪或qPCR仪,但不适用于自动化、应用。移液过程中稳定性不高,需要配合板托使用。
半裙边板:可适配标签或应用条码,及自动化应用,且有着较好的移液稳定性。
全裙边板:非常适用于自动化实验应用,也可适配标签及应用条码。机械强度较好,可适用于凸出模块的PCR仪,且移液过程中稳定性高。
六、96和384孔板切角和标识不同?
答:A切角:PCR板的切角位置选择取决于适配仪器要求,便于定位。
B标识:PCR板的数字字母标记有助于识别单个孔及样品位置。
一般为凸出的颜色数字标识或者印刻标识。对于一些自动化应用实验,印刻标记的反应板密封性会更好。
七、为什么有的PCR板孔缘是升起的?
答:常见的PCR板有平孔缘和加高孔缘两种。
平孔缘的反应板,可适用于大多数的PCR仪。
升孔缘的反应板,便于封膜,可降低样品间的交叉污染风险。
八、PCR封板膜有多种类型,哪种好?
答:根据具体的PCR实验要求选用适配的高质量封板膜,不仅有效保护样品,防止污染,还提供可信赖的实验检测数据。

(内容来源:德国BRAND 由小析姐整理编辑)

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