实验时间|如何用流式检测细胞凋亡？
前言
细胞凋亡通常称为细胞程序性死亡，是由基因控制的主动性细胞死亡过程。越来越多数据发现，细胞凋亡与多种疾病密切相关，如癌细胞具有连续增殖、抵抗细胞凋亡能力，利用流式细胞仪分析细胞凋亡可为肿瘤诊断，疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。然而很多实验的同学们，常会碰到上机检测时细胞死亡太多却检测不出凋亡，多次重复结果不一致等现象，本文就一起看看如何把细胞凋亡的数据变的更加漂亮，准确！
首先，明确一下细胞凋亡和坏死的区别
细胞凋亡(apoptosis)是一件主动性细胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控，是细胞为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。具体表现为：出芽形成凋亡小体、核小体间DNA的切割，凋亡小体被吞噬和消化等几个连续过程等[1]（如下图所示）。
图1：细胞凋亡的发生过程[1]
细胞坏死（necrosis）则是一件被动的过程，是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，即病理条件下，自体损伤的一种现象。具体表现为：细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，会引起局部严重的炎症反应（如下图所示）。
图2：细胞坏死的发生过程[1]
一
流式检测细胞凋亡的原理
Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法，它是基于凋亡的早期细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine, PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面这一原理来实现的（如下图3）。
图3：凋亡早期 PS从细胞膜的内侧外翻
该方法简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，具体原理如下：
Annexin Ⅴ（膜联蛋白 V）是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，将Annexin V 进行荧光素FITC标记，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（Propidium, PI）是一种可与DNA结合的染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此，将Annexin V与PI联合使用时，便可用来鉴别活细胞，凋亡细胞及死亡细胞。
二
实验操作步骤
收集细胞：取适量的对数生长期细胞接种于6孔板中，在相应的条件下（如药物）处理相应时间后，收集细胞，注意要合并上清和消化下来的细胞（注：悬浮细胞直接离心即可）；
清洗细胞：用预冷的PBS洗2遍细胞；
分组：每一次实验分为不染组、单染Annexin V组、单染PI组以及PI和Annexin V双染组，处理组按从低到高进行双染；
染色：用PBS把4×binding buffer稀释到1×缓冲液，吸净离心管残余的PBS后，每管加入100μL的1×的binding buffer，用移液枪吹打细胞使细胞充分重悬，避光条件下加入染料。不染组不加，单染组加Annexin V或PI 5μL，Annexin V和PI双染组加入Annexin V 和PI各5μL，并用移液枪轻轻混匀；
上机检测：室温避光孵育15分钟后，加入1×的binding buffer 300μL并混匀后避光下将细胞悬液转移到5mL的流式管中，1h内在流式细胞仪上机检测。
三
数据分析
Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针，FITC最大激发波长为488 nm，最大发射波长525 nm，FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm，PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。通过软件分析，绘制双色散点图，FITC为横坐标，PI为纵坐标。
如下图所示：细胞可以分为4个象限：
图4：4个象限的细胞分布图
Q1：左上象限（UL）为（Annexin V-/PI+），可能是已经没有细胞膜的细胞碎片，或者其他原因导致的死亡细胞；
Q2：左下象限（LL）为正常（活）细胞（Annexin V-/PI-）；
Q3：右上象限（UR）为晚期凋亡细胞（Annexin V+/PI+）；
Q4：右下象限（LR）为早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）。
举例：如常用于研究药物或者基因等对细胞凋亡的影响。通过比较Control组和药物组，发现化合物可以诱导前列腺癌细胞系PC-3M的细胞凋亡，处理组（20μM）的晚期凋亡细胞比例与Control组（0μM）相比，从1.79%上升到11.39%。进而还可根据每个象限的数据计算出活细胞、凋亡细胞和坏死细胞百分率。
图5. 药物浓度梯度依赖性的诱导PC-3M细胞凋亡[2]
四
常见问题解答
1. 如何避免出现假阳性结果？
细胞接种不易过密：接种对数生长期的细胞时密度不要＞1*106，以免细胞培养过程中自身引起凋亡，而非外界处理因素；
避免消化过度：因消化过度可能会造成PS外翻，得到假阳性的结果。因此消化时最好用低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2-3次，尽量把胰酶造成损伤可以控制在5%以内，加上对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响；
操作尽量轻柔：收集细胞时力度过大很可能造成细胞膜损伤，导致细胞膜的磷脂层暴露，从而结合Annexin V，导致假阳性，因此处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤。
2. 为什么必须收集细胞上清？
因为凋亡的细胞可能会脱壁，悬浮于培养基，所以必须收集上清再离心取沉淀，合并胰酶消化下来的细胞，不然检测出来的凋亡比例可能会减少。
3. 为什么在染色后1h内就要上机检测？
由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析；PI受时间的影响很大，因标记了PI后会加大细胞毒性，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大，所以建议在一个小时内检测。
4. 其他注意事项
消化是关键步骤，注意消化时间和操作力度，过短的话细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成膜损伤，过长又易造成假阳性；
Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光；
避免洗涤时细胞损失过多，可考虑在吸液时用大的Tip头套上小的Tip头吸液；
上机检测时，必须重悬成细胞悬液后再检测，否则容易堵仪器管道；如果细胞过多或聚团严重，可先用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，然后再上机检测；
注意：FITC为绿色荧光，此检测方法不适用于已带绿色荧光标签的细胞；
如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。
[1]Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007;35:495-516.
[2]Qin M, Peng S, Liu N, et al. LG308, a Novel Synthetic Compound with Antimicrotubule Activity in Prostate Cancer Cells, Exerts Effective Antitumor Activity.[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2015,355(3): 473-483.
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