【特别推出】跨界通讯，青枯菌走到了哪一步？
本期文献解读为大家献上中山大学药学院（深圳）邓音乐教授团队的最新研究成果：解析植物病原青枯菌新型跨界通讯系统的调控机理和功能。当地时间2020年5月26日，成果在微生物生态学顶级期刊The ISME Journal在线发表，题为“Anthranilic acid from Ralstonia solanacearum plays dual roles in intraspecies signalling and inter-kingdom communication”。
自然界危机四伏，有环境的压力，也有竞争者的威胁。为了生存、繁衍、形成种群优势，微生物各出奇招。万变不离其宗，能否快速完成细胞之间的信号传导，能否高效进行跨界通讯，是微生物立足环境、争夺资源、抢占生态位的根本。要形成种群优势、群体作战，微生物就离不开其中央司令部——群体感应系统，这对细菌性病原微生物尤为重要。在复杂的自然环境中，病原细菌和病原真菌常纵横交错，这时的它们是举案齐眉，还是你争我夺？狭路相逢勇者胜，看病原细菌中央司令部新晋的高级指挥官，如何智取病原真菌！
病原细菌相对病原真菌是否具有竞争优势？如果是，其作用效果和机制如何？
为了回答上述的科学问题，作者以细菌性模式植物病原青枯菌（Ralstonia solanacearum）和真菌性病原菌黑粉菌（Sporisorium scitamineum）为研究对象，通过平板对峙实验发现青枯菌分泌的拮抗物质能够显著抑制黑粉菌的生长发育。随后作者利用质谱分析和活性成分检测明确了青枯菌代谢物中发挥拮抗作用的功能组分，进而解析该组分拮抗抑制黑粉菌的生理生化和分子调控机制。为进一步解析该功能组分的生物合成关键途径及其生物学功能，作者综合利用生物信息学、分子生物学、转录组学等方法，探究相关基因对青枯菌群体感应相关毒力行为和毒力基因表达调控的影响。最终，作者发现了一种新型跨界通讯信号分子——邻氨基苯甲酸，主要由TrpEG系统调控。该系统属于全局性群体感应调控系统，且在大多数细菌中保守。
一、青枯菌通过产生邻氨基苯甲酸抑制黑粉菌的生长发育
为了解青枯菌与黑粉菌之间的竞争关系，作者通过平板对峙实验，发现青枯菌明显抑制黑粉菌的有性生殖和菌丝发育（图1a-b），而大肠杆菌不能影响黑粉菌的正常生长发育（图1c）。为进一步明确发挥抑制作用的组分，作者首先通过收集青枯菌的发酵萃取液，发现其同样能够抑制黑粉菌有性生殖和菌丝发育（图1d），证明青枯菌的代谢产物具有跨界拮抗功能。随即，作者利用高分辨率电喷雾电离质谱分析和单一组分活性分析鉴定得到了发酵液中发挥关键抑制作用的功能组分——邻氨基苯甲酸（Anthranilic acid，以下简称AA），同时AA的拮抗作用具有显著的剂量效应（图1e）。结果表明：青枯菌主要通过产生AA抑制黑粉菌的生长繁殖。
图1 青枯菌通过AA抑制黑粉菌的生长发育
二、解析AA抑制黑粉菌生长发育的作用机制
大量研究表明，丝裂原活化蛋白激酶、环腺苷酸和蛋白激酶A等系统（PKA-cAMP）与真菌的有性繁殖和菌丝发育有关，那么青枯菌产生的AA是否靶向干扰PKA-cAMP途径从而抑制黑粉菌的生长发育呢？为此，作者通过qRT-PCR发现AC显著抑制pra, gpa3, uac1, adr1, prf1, mfa, bE和bW等PKA-cAMP途径相关基因的表达水平（图2a）。结果表明：AA通过抑制黑粉菌PKA-cAMP通路中多个基因的转录表达，从而干扰了黑粉菌有性繁殖和菌丝发育（图2b）。
图2 AA对黑粉菌PKA-cAMP途径的抑制作用
三、TrpEG调控青枯菌AA的生物合成
为探究AA的生物合成途径，作者通过生物信息学分析发现青枯菌含有两套与AA合成相关的系统——TrpEG（与铜绿假单胞菌同源）和kynABU（与假单胞菌同源）。基因敲除和高效色谱检测发现：trpEG缺失株几乎不能产生AA（图3a），kynAUB缺失株AA的产量略微降低（图3b），TrpEG和KynAUB双系统缺失株完全不能产生AA（图3b），因此作者判断TrpEG是控制AA合成的主要途径。为进一步探究TrpEG生物合成AA的能力，作者将青枯菌trpEG基因克隆到大肠杆菌中进行异源表达，结果发现纯化的TrpEG蛋白能直接催化分支酸向AA的转化（图3c）。结果表明：TrpEG参与调控青枯菌AA的生物合成。
图3 TrpEG控制青枯菌AA的生物合成
四、TrpEG调节青枯菌QS相关生物学功能
青枯菌的体外培养和翻译融合结果发现，AA的产生和trpEG的表达受青枯菌种群密度调控，推测trpEG可能与群体感应系统有关。为此，作者比较了trpE、trpG和trpEG基因的缺失对生物膜形成能力、纤维素酶和胞外多糖产量以及运动性等青枯菌群体感应相关毒力表型的影响。结果显示，突变菌株的毒力行为呈现不同程度的减弱，其中trpEG的缺失对毒力行为的影响最为严重，而外源添加AA可以弥补trpEG缺失引发的生理生化功能缺陷（图6）。不仅如此，qRT-PCR进一步表明，AA能够显著减弱phcA, phcB, solI和eps等群体感应相关毒力基因的表达。值得注意的是：phc和sol分别是青枯菌全局性群体感应系统和局部性群体感应系统。结果表明：TrpEG很可能是位于青枯菌phc和sol系统上游的全局性群体感应调控系统。
图4 TrpEG对群体感应相关毒力生理行为的影响
五、TrpEG调控青枯菌的根系定殖及致病力
图5 TrpEG对青枯菌毒力的影响
六、TrpEG系统在细菌中广泛存在
既然TrpEG/AA系统对青枯菌的种内信号传导和跨界拮抗竞争这么重要，那么TrpEG是青枯菌所特有的系统，还是普遍存在的呢？为此，作者通过生物信息学分析，发现TrpEG在大量细菌中普遍存在（图6），但这些菌株是否能够产生AA呢？作者随即挑选了6个不同属的细菌进行LC-MS检测，发现所选菌株均能大量产生AA。结果表明：TrpEG/AA系统可能是细菌进行种内信号传导和跨界通信的一种通用的策略。
竞争无处不在，只有提升自我才是生存之本。青枯菌利用TrpEG/AA系统向内不仅可以调控信号传导、提升自身特性，向外还能打压黑粉菌、介导跨界通讯，从而获得生存优势。该研究进一步验证了群体感应系统在病原菌生物学功能和毒力控制中发挥的重要作用，丰富了我们对微生物跨界通讯的认识，也为抑制病原菌提供了新的思路，似乎以毒攻毒也是一个不错的方法呢！
第一作者：宋施豪，男，30岁，河南永城人。2014年本科毕业于河南农业大学，2017年硕士毕业于华南农业大学，2018年博士就读于华南农业大学，并前往新加坡南洋理工大学联合培养，主要开展青枯菌的新型群体感应系统和新型抗菌剂研究。目前以第一/共一作者身份在ISME J、 Mol Plant Pathol、 Mol Microbiol、 Microb Biotechnol、 Appl Environ Microbiol、 Molecules等期刊发表论文，并有一篇mSphere文章返修中，另有几篇文章正在整理稿件中。申请十多件发明专利，其中已有数件获得授权。
通讯作者：邓音乐，中山大学药学院（深圳）教授、博士生导师。国家海外高层次引进人才，广东省杰青，广东省珠江人才计划创新团队核心成员兼委托负责人，1997-2004年就读于南开大学并先后获得学士和硕士学位。2010年获得新加坡国立大学博士学位。主要从事微生物群体感应、病原菌致病机理、新型抗菌药物功能及作用机制等研究。以第一/通讯作者在Chem Rev、PNAS（2篇）、ISME J（2篇）、Environ Microbiol、Mol Microbiol 等权威期刊上发表SCI论文26篇，累积影响因子超170。申请国际发明专利7项，授权3项；申请国家发明专利28项, 授权13项。主持包括国家自然科学基金面上项目, 973子课题等多个省部级课题。多次出席国际国内学术会议作大会或分会报告。
供稿：张煜铃、张耀予
校稿：邓音乐、韦中、尹悦
封面：张耀予
全文链接：
https://www.nature.com/articles/s41396-020-0682-7
DOI: 10.1038/s41396-020-0682-7