一些单细胞转录组R包的对象
对象应该是很重要的，至少是在R语言里面
ExpressionSet
Bioconductor的ExpressionSet是基石，多次讲解过，GEO数据库在R里面下载的就是这个对象。
通常不需要自己从头创建。
而单细胞转录组本质上也是转录组，即表达量矩阵的分析，所以后面的R包的对象，其实或多或少借鉴了这个Bioconductor的ExpressionSet对象。
CellDataSet
来自于monocle这个R包，使用其提供的 newCellDataSet() 函数即可创建，创建后的对象组成成分如下
表达矩阵：rows as features (usually genes) and columns as cells
使用 featureData and phenoData 函数可以获取基因和样本信息
其中 expressionFamily指定表达矩阵的归一化形式
归一化形式通常是3种
tobit() FPKM, TPM
negbinomial.size() UMIs, Transcript counts from experiments with spike-ins or relative2abs(), raw read counts
gaussianff() log-transformed FPKM/TPMs, Ct values from single-cell qPCR
先介绍一下monocle需要的用来构建 CellDataSet 对象的三个数据集
表达量矩阵
exprs:数值矩阵 行名是基因, 列名是细胞编号.细胞的表型信息
phenoData: 第一列是细胞编号，其他列是细胞的相关信息基因注释
featureData: 第一列是基因编号, 其他列是基因对应的信息
并且这三个数据集要满足如下要求:
表达量矩阵必须：
保证它的列数等于
phenoData的行数保证它的行数等于
featureData的行数
而且
phenoData的行名需要和表达矩阵的列名匹配featureData和表达矩阵的行名要匹配featureData至少要有一列"gene_short_name", 就是基因的symbol
准备Monocle对象需要的phenotype data 和 feature data 以及表达矩阵，从 scRNAseq 这个R包里面提取这三种数据。
library(scRNAseq)
## ----- Load Example Data -----
data(fluidigm)
# Set assay to RSEM estimated counts
assay(fluidigm) <- assays(fluidigm)$rsem_counts
ct <- floor(assays(fluidigm)$rsem_counts)
ct[1:4,1:4]
sample_ann <- as.data.frame(colData(fluidigm))
gene_ann <- data.frame(
gene_short_name = row.names(ct),
row.names = row.names(ct)
)
pd <- new("AnnotatedDataFrame",
data=sample_ann)
fd <- new("AnnotatedDataFrame",
data=gene_ann)
sc_cds <- newCellDataSet(
ct,
phenoData = pd,
featureData =fd,
expressionFamily = negbinomial.size(),
lowerDetectionLimit=1)
sc_cds
这样就完成了CellDataSet对象的从头构建，它是后续分析的基石。
SingleCellExperiment
同样的也是那些信息：Different quantifications (e.g., counts, CPMs, log-expression) can be stored simultaneously in the assays slot. Row and column metadata can be attached using rowData and colData, respectively.
主要是scater包采用，也是可以从头构建。
创建代码如下：
library(scRNAseq)
## ----- Load Example Data -----
data(fluidigm)
# Set assay to RSEM estimated counts
assay(fluidigm) <- assays(fluidigm)$rsem_counts
ct <- floor(assays(fluidigm)$rsem_counts)
ct[1:4,1:4]
table(rowSums(ct)==0)
# 这里使用原始表达矩阵，所以有很多基因在所有细胞均无表达量，即表现为没有被检测到，这样的基因是需要过滤掉的。
pheno_data <- as.data.frame(colData(fluidigm))
## 这里需要把Pollen的表达矩阵做成我们的 scater 要求的对象
#data("sc_example_counts")
#data("sc_example_cell_info")
# 你也可以尝试该R包自带的数据集。
# 参考 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/scater/inst/doc/vignette-intro.R
sce <- SingleCellExperiment(
assays = list(counts = ct),
colData = pheno_data
)
sce
#
#
后面所有的分析都是基于 sce 这个变量 ，是一个 SingleCellExperiment 对象，被很多单细胞R包采用。
seurat 对象
主要是seurat包采用该对象，个人觉得并不是很方便，并不是上面的SingleCellExperiment 对象。
library(scRNAseq)
## ----- Load Example Data -----
data(fluidigm)
# Set assay to RSEM estimated counts
assay(fluidigm) <- assays(fluidigm)$rsem_counts
ct <- floor(assays(fluidigm)$rsem_counts)
ct[1:4,1:4]
names(metadata(fluidigm))
meta <- as.data.frame(colData(fluidigm))
counts <- ct
identical(rownames(meta),colnames(counts))
Pollen <- CreateSeuratObject(raw.data = counts,
meta.data =meta,
min.cells = 3,
min.genes = 200,
project = "Pollen")
Pollen
并不一定要对象
有些单细胞转录组R包，就没有封装为特殊的对象，而是简单的list即可，比如M3Drop这个单细胞转录组R包：
library(scRNAseq)
## ----- Load Example Data -----
data(fluidigm)
ct <- floor(assays(fluidigm)$rsem_counts)
ct[1:4,1:4]
sample_ann <- as.data.frame(colData(fluidigm))
counts=ct
library(M3Drop)
Normalized_data <- M3DropCleanData(counts,
labels = sample_ann$Biological_Condition ,
is.counts=TRUE, min_detected_genes=2000)
dim(Normalized_data$data)
length(Normalized_data$labels)
class(Normalized_data)
str(Normalized_data)
那你需要对象吗
你觉得对象重要吗，需要嘛？