细菌性败血症的免疫细胞特征
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摘 要
对细菌感染的免疫反应失调可导致败血症，这是一种死亡率很高的疾病。多项全血基因表达研究已经确定了脓毒症相关的分子标记，但尚未解析特定细胞类型转录状态的变化。在这里，研究者们使用单细胞RNA测序来分析脓毒症患者的血液(n = 29)，并通过3个临床组进行对照(n = 36)。研究者们分析了所有受试者的外周血单核细胞(PBMCs, 106,545个细胞)和树突状细胞(19,806个细胞)，并根据它们的基因表达谱聚类，定义了16种免疫细胞状态。鉴定了在脓毒症患者中扩增的独特的CD14+单核细胞状态，并利用来自不同疾病病因和多个地理位置的受试者的公开转录切片数据验证了其区分这些个体与对照个体的能力(18队列，n = 1467名受试者)。研究者们确定了一组用于分离和定量单核细胞状态的表面标记，并对其表观基因组和功能表型进行了表征，并提出了一个从人类骨髓诱导单核细胞状态的模型。这项研究证明了单细胞基因组学在发现疾病相关的细胞学特征方面的实用价值，并为深入了解细菌败血症免疫失调的细胞基础提供了思路。
样品
脓毒症患者和对照组的PBMC,主要研究对象是病程早期存在尿路感染(UTI)的患者，发病后12小时内就诊于急诊科(ED)(图1b-e)。
图1
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测序
Chromium platform
3′ v2 profiling chemistry (10X Genomics)
研究者们对脓毒症患者和对照组的PBMC进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)，以确定这些受试者的细胞状态范围，识别组间细胞状态组成的差异，并检测区分脓毒症与正常的细菌感染免疫应答的免疫信号(图1)。使用3’tag RNA-seq方法分析了总PBMC的CD45+ (每个受试者1000 - 1500个细胞)和LIN - CD14-HLA-DR +树突状细胞(每个受试者300-500个细胞)。研究者们在每个实验中使用细胞哈希对6-8个样本进行多路复用，在研究者们的数据中没有观察到主要的批量效应(扩展数据图1和方法)。
ATAC-seq在25000个已排序的细胞上进行
数据分析方法
研究者们通过对细胞进行分两步聚类来识别免疫细胞状态:低分辨率聚类来识别主要的免疫细胞类型(图1f)，然后以稳健的方式对每个主要细胞类型分别进行子聚类。
图1
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单细胞数据预处理
GRCh38
cell ranger v2.1
scanpy（每个基因至少有10个细胞;每个细胞的最小UMI值为100）
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ATAC-seq data analysis
NextSeq (Illumina)
ATAC-seq pipeline (https://www.encodeproject.org/atac-seq/)
'multiinter’ function, function 'coverageBed’ from bedtools v2
edgeR,Homer v4.1('findMotifsGenome’)
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Bulk RNA-seq processing and data analysis
Smart-Seq2,edgeR and custom python scripts
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Data availability
scRNA-seq data:Broad Institute Single Cell Portal (https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell):
SCP548 (subject PBMCs) and SCP550 (bone-marrow stimulation).
Raw sequencing data:Broad DUOS (https://duos.broadinstitute.org/).
Code availability:https://github.com/reyes-m/sepsis_signature.
数据分析结果及实验验证
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scRNA-seq在多个临床队列中定义脓毒症患者的免疫细胞状态
两步聚类在不同的队列和处理批次后发现了16种不同的细胞状态(每个状态n = 31-69)(图2a和扩展数据图2e,f)。研究者们发现了4个不同的单核细胞组:MS1，高表达CD14+ resistin (RETN)、花生四酸酯5-脂氧合酶活化蛋白(ALOX5AP)和白细胞介素-1受体2 (IL1R2)(图2b);MS2，具有II类主组织相容性复合体(MHC)高表达的特点;MS3,类似于非经典的CD16hi单核细胞;MS4是由剩余的CD14+细胞组成，它们同时表达低水平的II类MHC和炎性细胞因子。研究者们注意到，在测定血清蛋白或全血信使RNA水平的研究中，一些表征MS1状态的标记基因曾与败血症相关
图2
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单核细胞状态MS1在脓毒症患者血液中的扩增
研究者们发现，血液中细胞状态的丰度与个体的疾病状态密切相关，而绝对丰度与个体的疾病状相关度要弱。尽管在对照组、Leuk-UTI组和脓毒症组(Int-URO、URO、Bac-SEP和ICU-SEP)中，经典细胞类型的比例存在显著差异，但研究者们发现，从聚类中得出的特定细胞状态的相对丰度存在更明显的差异，尤其是在MS1中(图2c)。
图2
鉴于MS1在脓毒症患者中的扩展，研究者们认为，分析MS1细胞内的基因表达特征可能会揭示有用的脓毒症临床标志物，并进一步深入了解其生物学机制。研究者们寻找能够区分脓毒症和没有细菌感染的危重症的特征，因为这些队列不能仅通过细胞状态的丰度来进行显著区分因此，研究者们鉴定了ICU-SEP和ICU-NoSEP受试者中MS1细胞中差异表达的基因(图2d)，并发现了两个基因，胎盘相关的8 (PLAC8)和clusterin (CLU)，这两个基因区分了这两个受试者群体(图2e和扩展数据图7c)。
值得注意的是，在研究者们的主要队列中，与线粒体呼吸对应的MS1细胞模块中基因（(MS1-A; MT-ND4, MT-CO3, MT-ATP6) ）与脓毒症患者的疾病严重程度显著相关(IntURO和URO, FDR = 0.03;图2f)，支持能量代谢改变与败血症免疫麻痹之间的联系。
图2
此外，MS1中的一个基因模块(MS1-B; S100A8, RETN, ALOX5AP, FPR2)与抗炎和促解反应相关(与严重程度负相关(FDR = 0.04)(图2g和扩展数据图7g)，与当前脓毒症模型一致，即患者在疾病早期出现炎症状态升高，但随后切换到免疫抑制状态。
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验证MS1标记作为脓毒症的标记
研究者将的他们选出的标记与之前报道的分类器进行性能比较，量化了MS1级分的分类精度，MS1细胞中的PLAC8 + CLU表达，以及研究队列中公开的基于基因的标记(图3a)。
图3
研究者们扩展此方法到最近的11个队列中的荟萃分析的bulk 转录数据,发现在每项研究中，脓毒症患者的MS1状态的推断丰度高于对照组，所有患者的总效应值为1.9 (FDR = 1.75×10-30，图3b和补充表4)。
此外，每个受试者单独推断的MS1分数可用于在相同数据集中作为败血症的分类器，所有研究的AUC总计为0.90(范围为0.81-0.98)(图3d)，与来自bulk测序的基因表达的分类器表现相似。
图3
在比较脓毒症患者与ICU对照组(非感染性全身炎症反应综合征患者)的7个数据集的类似分析中，有9个数据集(扩展图9)。(图3 de)， MS1在脓毒症中扩大，虽然其效应值较低，但显著为0.32 (FDR = 0.08)，这与研究者们的研究结果一致。
然而，单以MS1分数不能作为败血症的分类器，通过分析这些数据集中的PLAC8、CLU和MS1标记基因(RETN、CD63、ALOX5AP、SEC61G、TXN和MT1X)的共表达，可以很好地对败血症患者进行无菌性炎症的分类(图3e)，总结AUC为0.81(范围为0.63-1.00)，与已发表的特征值(扩展数据图9d,f)类似。
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分离MS1细胞的表面标记
为了提高其作为细胞学标记的效用，研究者们鉴定了一组表面蛋白，可以通过流式细胞术来确定MS1细胞的状态。区别于其他CD14+单核细胞的差异表达基因、低HLA-DR和高IL1R2表达可用于定量MS1细胞的比例(图3f)。
图3
与此形成对比的是，HLA-DRlo IL1R2hi CD14+单核细胞在in -URO和URO受试者中出现的频率高于对照组和Leuk-UTI受试者(图3g)，通过流式细胞术测量的分数与scRNA-seq测定的分数显著相关(Pearson r = 0.87)(图3h)。此表型排序的细胞与来自5个URO研究对象的7098个细胞一起分析，通过表达谱与投射到相同的t-SNE图时，此细胞与研究者们原始数据集中的MS1细胞共定位(图3i)。
图3
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从人类骨髓中产生类似MS1的细胞
研究者们推测MS1细胞可能来自骨髓单核细胞(BMMCs)，其中包括造血前体，而不是来自外周血中的成熟免疫细胞。研究者们发现，使用Pam3CSK4 (Pam3)或脂多糖(LPS)对BMMCs进行慢性刺激，可导致HLA- DRlo IL1R2hi群的出现，其占总CD14+ CD14+群的一小部分(图4a)。这种细胞的丰度在处理过的BMMCs中随时间显著增加，而在处理过的PBMCs中没有增加(图4b)。
图4
此外，经LPS或Pam3CSK4处理的BMMCs的scRNA-seq分析显示，有细胞群得到MS1标记基因，在未经处理的情况下就没有。(Fig. 4c,d and Extended Data Fig. 10a–e)。
图4
对髓系群体的轨迹分析表明，MS1样诱导群体(iMS1, Leiden cluster 14)最初通过与非刺激条件下细胞相似的分化途径进行，但随后偏离了这一方向(图4e和扩展数据图10f,g)。
图4
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MS1细胞的表观基因组景观和转录调控因子
四个细胞群全基因组ATAC-seq谱的主成分分析表明，PB-Mono和BM-Mono共域，而PB-MS1和BM-iMS1形成不同的簇，但在PC2上共享相似的PC2(图4f)。
通过对PB-Mono和PB-MS1的差异峰进行Motif富集分析，可以发现FOS-Jun、PU.1和CEBP Motif的富集，它们都是单核细胞发育过程中起关键作用的转录因子家族38(图4g、h和补充表5)。考虑到它们在炎症诱导的骨髓生成过程中所起的重要作用，我们分析了CEBP转录因子的表达。在bulk-seq 的数据分析中，和 PB-Mono相比， PB-MS1显示CEBPD 、CEBPE增加和CEBPG表达减少,同样在BM-iMS1和BM-Mono相比中(图4i)。分析骨髓祖细胞向iMS1细胞的分化轨迹也发现，从GMP状态过渡后CEBPD表达增加(图4j)。
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MS1细胞对再刺激的功能反应
为了比较MS1细胞与其他CD14+细胞的功能反应，我们对4个单核细胞种群进行了分类，用100 ng ml-1LPS刺激后静息24小时。分析得到,LPS刺激导致细胞因子分泌和激活核factor-κB (NF-κB)信号通路的基因的上调(图4 k和补充表6)。然而, 反应的大小在PB-MS1相对于PB-Mono细胞和在BM-iMS1相对于BM-Mono 细胞中减少,就是由于更低的基底和肿瘤坏死因子(TNF)的诱导表达的基因,和更少的分泌TNF-α蛋白(图4 l m)。通过分析刺激后差异表达基因的重叠，可以发现在PB-MS1中有大量基因被特异上调(图4n)。
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